单细胞蛋白的生产.doc

目录1 前言21.1 单细胞蛋白饲料的优点21.1.1 蛋白质含量丰富21.1.2 原材料来源广泛31.1.3 生长速度快31.1.4 不受季节和气候等条件的影响31.2 细胞蛋白生产的菌种类型31.3 单细胞蛋白的生产工艺的类型41.3.1 液体深层发酵法441.3.2 固体发酵法41.4 单细胞蛋白饲料的应用42 菌种的选育42.1 菌种的选取及筛选52.1.1 菌种的选取52.1.2 菌种的采集52.1.3培养菌62.1.4菌种的初筛62.1.5菌种的复筛1162.2 诱变育种62.3菌种的保藏73 培养基的配制83.1 配置培养基的原则83.2培养基类型83.2.1 孢子培养基83.2.2 种子培养基83.2.3发酵培养基93.3 热带假丝酵母菌的培养基及培养条件93.4培养基的设计93.4.1 碳源93.4.2 氮源93.4.3 水103.4.3 无机盐及微量元素104 灭菌104.1 仪器灭菌104.2 培养基灭菌114.2.1 分批灭菌114.2.2 连续灭菌114.3空气除菌114.4 发酵罐除菌125 种子扩大培养125.1 实验室种子的制备125.2 生产车间种子制备126 发酵罐的工艺设计136.1 发酵罐的结构136.2发酵罐的工艺尺寸146.2.1 发酵罐的工艺计算156.2.2物料衡算167 发酵工艺控制167.1发酵过程温度的影响及控制167.2 pH对假丝酵母生长的影响177.3 KH2P04含量对假丝酵母生长的影响177.4 氧气对酵母菌生长的影响177.5染菌的控制178下游加工188.1预处理和固液分离188.2 提取和干燥18参考文献2022摘要：单细胞蛋白(Single cell protein，简称SCP)指的是单细胞菌体蛋白，其蛋白含量高，营养丰富。单细胞蛋白蛋白质含量比豆粉高1020，可利用氮比大豆高20。因此，利用非食用资源和废弃资源(如农副产品下脚料和工业废液等)开发和推广单细胞蛋白的生产，将成为补充饲料蛋白质来源不足的重要途径，意义十分重大1。本设计利用生产味精的废液为原料，采用热带假丝酵母液体发酵制取单细胞蛋白饲料，探索出具有工业化应用潜力的工艺路线。味精废液是味精生产过程中发酵液中的谷氢改经冷冻等电后分离的残余发酵液。这部分废液含有还原糖0.5，氨氮896mgL，有机氮76mgL，COD 51216g/L，是当前污染环境、破坏水生生态平衡的污染源。用此液培养假丝酵母，在30、1：1通气条件下，12小时后菌体干物质达20g/L左右。关键词：单细胞蛋白， 酵母菌， 味精废液， 发酵1 前言以味精废液为原料生产饲料酵母，废液不经过滤，只需加少量氨水，用热带假丝酵母酵母直接发酵，工艺简单，操作简便。味精废液通过酵母发酵后，COD去除率达60左右。因此，利用味精废液生产饲料酵母，不仅能减轻污染，保护环境，同时又是一条开辟蛋白质饲料来源的新途径，对促进畜禽养殖业的发展具有重大的意义。味精废液生产的饲料酵母，蛋白质含量高达60，其中含有18种氨基酸，并合有丰富的B族维生素，因此是一种富含氨基酸、维生素的全效价蛋白质饲料。经动物蛋白质利用试验表明，鸡、猪的消化吸收率分别达8853和85.7。通过在猪、鸡粮中添加饲料酵母与鱼粉进行饲喂对比试验证明，词喂味精废液饲料酵母的经济效益比进口鱼粉高。 表1 味精废液的主要成分 1.1 单细胞蛋白饲料的优点1.1.1 蛋白质含量丰富 单细胞蛋白蛋白质含量一般在40以上(细菌含蛋白质5080，酵母菌含蛋白质4060，藻类含蛋白质4050，霉菌含蛋白质2030)，并且氨基酸的含量齐全，比一般蛋白质营养价值高，此外还含有丰富的维生素和未知因子6。因此，单细胞蛋白饲料可称得上是一种全价的蛋白质饲料，可部分代替鱼粉饲喂动物。 表2 饲料酵母、鱼粉、豆饼的化学成分1.1.2 原材料来源广泛 生产单细胞蛋白饲料的原料来源很广：农业副产品，如糖渣、果渣、淀粉渣、饼粕；工业废液，如酿酒工业副产品、淀粉工业副产品、味精工业副产品、柠檬酸工业副产品；造纸废液、味精废液、豆腐废水、甘蔗糖蜜废液、有机废水、啤酒混合废液等。除此外还有植物纤维素如植物秸秆，皮、壳、芯、林业废弃物。微型藻类，作饲料的藻类有螺旋藻和小球藻等单细胞藻类，其中钝顶螺旋藻和极大螺旋藻最理想，蛋白质含量一般为6070。1.1.3 生长速度快 单细胞生物世代周期短，生长繁殖速度快，在良好的条件下，微生物干物质产量在24 h内可增加1倍以上，其富集蛋白质的能力远远高于动植物。因此，以工业方式生产单细胞蛋白能比较快地提高饲料蛋白的产量。1.1.4 不受季节和气候等条件的影响单细胞蛋白的生产不受季节和气候、土壤、自然灾害的影响，可以在工厂里进行，与传统的农业生产方式相比，过程易于控制，可以节省耕地、人力和能源。1.2 细胞蛋白生产的菌种类型 可用于生产单细胞蛋白的菌种类别很多。大致可以分为酵母菌、细菌、真菌和微藻2。其中，酵母菌主要包括白地霉、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、啤酒酵目等等3。常用的酵母菌有啤酒酵母、产院假丝酵母和热带假丝酵母菌等，前者只能利用己糖，而后者能利用戊糖和己糖，在缺乏营养的培养基中生长很快。饲料酵母应用广泛，是将酵母菌繁殖在适当的工农业副产品上而制成的一种饲料。酵母菌核酸含量较低，容易收获，且在偏酸环境下(pH 4.5-5.5) 能够生长，可减少污染4。虽然真菌的蛋白质含量为3060，但缺乏蛋氨酸，这可在加工过程中添加02蛋氨酸加以解决。用藻类生产单细胞蛋白已有很长的历史，但藻类不易消化和代谢。 表3：外农产品加工废料为原料研制单细胞蛋白饲料主要情况1.3 单细胞蛋白的生产工艺的类型1.3.1 液体深层发酵法4液体深层发酵法是将糟液分离得到的废糟水，添加营养盐和适当玉米浆，调节pH 至4.4，接种假丝酵母等多株菌种混合发酵，再经分离、干燥得到成品。液体深层发酵法产量大、机械化程度高、易于监控，适合于工业化生产，但投资大、生产成本较高。1.3.2 固体发酵法固体发酵是指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上的发酵过程。固态态的湿培养基一般含水量在30%-70% ，而无游离水流出，此培养基通常是“手握成团，落地能散”。一般只在麦麸、棉菜柏、次粉、玉米蛋白粉及其他非常规饲料中加适量废渣水，适度灭菌后，接种假丝酵母、黑曲霉、米曲霉等进行发酵，烘干后制成蛋白饲料5。1.4 单细胞蛋白饲料的应用 在饲料工业上的应用：单细胞蛋白作为饲料蛋白，已被世界广泛应用。例如用假丝酵母及产朊酵母作为菌种，利用亚硫酸废液或石油生产酵母菌体，可用于牲畜饲料。用它喂养家禽、家畜，效果好、生长快，奶牛产奶多。鸡产蛋率增高，并能增强机体免疫力。稻壳可生产单细胞蛋白饲料。在食品工业上的应用：SCP蛋白特别是由农副产物原料生产的酵母菌和假丝酵母及最近美国用乙醇为原料生产的SCP可用作人类食品，是食品工业的重要蛋白质来源。酵母蛋白具有黏性和凝胶性、起泡性、水合性、成纤性和组织成型性等功能特性，因此，除可作为食品直接食用外，还可广泛应用于食品加工中。2 菌种的选育一般菌种分离纯化和筛选的步骤如下：生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落移种保藏进一步选育或斜面种子(初筛)高产菌株沙土管菌株斜面种子摇瓶复筛高产纯化株生产试验生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落2.1 菌种的选取及筛选2.1.1 菌种的选取 本设计选用热带假丝酵母，热带假丝酵母在28-30的麦芽汁中培养24h，原本清澈的麦芽汁以十分混浊，瓶底有白色菌体沉淀。在400倍显微镜下，观察在麦芽汁培养基中接种48h后菌种的形态图可见，菌种正处在生长旺盛期，成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。 图1 热带假丝酵母的形态2.1.2 菌种的采集 土壤是微生物的大本营，种类多，数量广。在那里几乎可以找到各种有用的微生物，因而是最常采集的样品。采集土样时应注意土坡的肥瘦、采土深度、伞坡湿度、pH值、采土季节、植被等条件。采土后要尽快分路否则要影响微生物种类的组成。本设计使用的热带假丝酵母在土壤中选取。2.1.3培养菌菌种还需要纯化筛选。每个250 mL三角瓶加100 mL种子培养基，灭菌后接人斜面菌种1环。培养条件：摇床转速160 rmin，培养温度3O ，培养时间20 h，备用11。将得到的菌株，挑取生长状况良好的,菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状菌落重新接入富集培养基上培养。2.1.4菌种的初筛用常规微生物分离方法， 将抽块样品进行稀释，分别从活化的斜面上用无菌水洗下，制成菌悬液，稀释至10-6后，取lml涂布于平皿，划线分离，静止培养2d，观察固体平板上各菌株的生长情况，以菌落大小，颜色，凸起程度。生长速度为评价标准。挑选出生长迅速，菌落大且凸起的酵母菌作为酵母复筛的初始菌株11。2.1.5菌种的复筛11将分离到的热带假丝酵母，接种到发酵培养基中，30静止培养24h倒瓶1次，发酵培养60h，并在发酵过程中每隔12h监控1次真蛋白质含量。用凯氏定氮法、氮基酸分析法等进行复筛， 选出高蛋白含量的酵母菌株。2.2 诱变育种诱变育种是利用物理、化学等诱变因素处理微生物群体诱发基因发生突变，然后根据育种目标，从无定向的突变抹中，筛选出我们所需要的菌种。诱变育种的理论基础是突变，大致步骤如下：出发菌种斜面单孢子悬液或摇瓶培养24h原种特性考察细菌悬液诱变处理稀释涂平板处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌记数并统计存活率挑取单菌落传种斜面观察单菌落形态；并统计其形态变异率摇瓶初筛挑出高产斜面对照组比较留种保藏菌种 （埋制沙土管、冷冻管或制备固体孢子）传种斜面（或直接用固体孢子）摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数，以及培养基种类根据情况而定挑出高产菌株作稳定性实验和菌种特性考察对照组放大罐实验，中试考察大型投产2.3菌种的保藏 优良菌种被分离选育出来后，必须尽可能保持其原来性状和活力不变异，不死亡，不被污染。但在自然条件下，菌种的污染、死亡和生产性能的逐渐下降又是不可避免的。为了解决这一矛盾，就必须采取妥善的的保藏方法，以便随时供应优良菌种给生产、科研使用12。菌种保藏是进行微生物研究和微生物育种工作的重要组成部分，其首要任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面发展。菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少变异。一般可通过保持培养基成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。菌种常用的保存的方法有斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。3 培养基的配制3.1 配置培养基的原则培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。在设计培养基时要根据不同细胞和不同用途的不同要求，确定各组分的种类和含量考虑C、N源时速效与长效相搭配有合适的C、N比生理酸、碱性盐及缓冲液搭配各种培养基成分用量需要根据试验结果来定，如果代谢成分清楚可以进行物料衡算来做参考选择成分时，应注意原料的货源，价格，加工方式等以保证生产正常进行，降低成本。3.2培养基类型培养基可以按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。3.2.1 孢子培养基 孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。培养基的营养不要太丰富，特别是有机氮源要低一些，否则孢子不易形成。无机盐的浓度要适当,否则会影响孢子的颜色和数量。应注意培养基的pH值和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小麦培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。3.2.2 种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。应该提供速效碳源如葡萄糖等；氮源也要提供一些易于利用的；磷酸盐的浓度可以适当高一些；总之要相对丰富、完全、并要考虑能够维持稳定的pH值。一般种子培养基都用营养丰富的而完全的天然有机氮，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮容易利用，有利于菌体的迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机氮源和无机氮源。3.2.3发酵培养基 发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。3.3 热带假丝酵母菌的培养基及培养条件 A: 斜面培养基：5Be麦芽汁，麦芽汁10，琼脂2，PH值自然，112KPa灭菌20min9。B: 种子培养基: 葡萄糖100、(NH )2SO 21、尿素1O、酵母粉20、MgSO4 11、K2HPO4 10、KH2PO4 050。250 mL三角瓶装液量100 mL13。C：种子罐培养级味精生产废液 。D：发酵培养基：味精生产废液。味精生产废液：经一步冷冻等电发提取谷氨酸后的废液，其成分含量（g/100ml）:残糖 0.6-0.8，全氮 0.8-1.0，谷氨酸 1.0-1.4，速效磷 0.008-0.015，COD 50000-60000mg/L,BOD 25000-30000mg/L,pH 3.210。3.4培养基的设计3.4.1 碳源碳源是构成酵母细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质，同时又是合成细胞所需生物能量的来源，一般情况下每生长1g酵母干固物理论上需碳水化合物2g左右。蛋白酶的生产既受分解代谢物阻遏也受底物的诱导，葡萄糖等容易利用的碳源常可引起分解代谢阻遏使产酶降低，故通常用大麦粉、玉米粉、淀粉，有时也用麦芽糖为碳源。3.4.2 氮源氮源是构成细胞中所含蛋白质、核酸、酶等成分，以及代谢产物中氮素来源的营养物质，所有酵母在生长时均可利用无机氮源。工业生产中通常使用的氮源有氨、铵盐和尿素。当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。常用的氮源有有机氮源和无机氮源两大类。黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、菌丝体和酒糟等都是有机氮源。无机氮源有氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。3.4.3 水 水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。水的比热较高，能有效的吸收代谢过程中所放出的热量，使胞内温度不致骤然上升。3.4.3 无机盐及微量元素无机盐是微生物发酵过程中的生长刺激因子，微生物生长必不可少的营养物质，它为机体生长提供必要的金属元素，维持了细胞的稳定性，能调节和保持细胞的渗透压平衡，可以控制细胞的氧化还原电位，从而提高生物活性。适量的有效无机盐可以促进微生物的快速繁殖。在某些情况下，没有一定的无机盐存在，微生物的生长非常缓慢，甚至不长。Mg2+是各种酶的激活离子，M92+的存在有助于提高酶的活性f971，对蛋白质的合成有较好的促进作用。Ca2+也是酶的激活因子。ca2+的加入可提高菌体中蛋白质的合成速度，添加05的过磷酸钙得到产品中粗蛋白含量最高。K+是细胞中重要的阳离子之一，是许多酶的激活剂，可促进碳水化合物的代谢。钾还与细胞膜的透性有密切关系，对维持细胞正常的渗透压作出了贡献。磷酸根离子是合成菌体核酸骨架的重要物质，也是许多重要辅酶的组成部分，参与糖类物质代谢中的磷酸化过程后迅速被同化为含磷的有机化合物微生物可以从无机磷化合物中获取磷，进入细胞后迅速被同化为含磷的有机化合物。分别加硫酸镁、磷酸二氢钾和过磷酸钙至039lOOmL、039lOOmL和0691 OOmL，调节pH为5O，在30"(2下发酵72h，经过干燥处理，可最大限度地获得酵母干菌体14。4 灭菌4.1 仪器灭菌在发酵操作过程中，种子活化、扩大培养需要接种环、摇瓶、试管等仪器。接种环应用火焰灼烧法灭菌；摇瓶、试管应用蒸煮法灭菌。经过灭菌是仪器不要暴露于空气中或于其它的未知仪器接触，并及时使用，以免再次带菌。4.2 培养基灭菌培养基和发酵系统的灭菌方法分为化学和物理两大类。前者采用能杀死微生物的化学药剂如甲醛、次氯酸钠、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐等进行灭菌；后者主要包括射线灭菌、加热灭菌和过滤除菌。加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌两种。干热灭菌：不如湿热灭菌有效，其Q10为23，而湿热灭菌对耐热的芽孢可达810，对营养细胞则更高。在培养基湿热灭菌时，不仅微生物会死亡，培养基中一些热敏性物质也会因受热而被破坏。所以灭菌时应以瞬时高温灭菌为宜。过滤除菌是利用能截留微生物而透过液体或空气的过滤介质的除菌方法。选择适当的过滤介质，既能过滤空气以制备无菌空气供给好样微生物发酵过程，又能对液态培养基进行澄清与灭菌，或制备液态无菌产品。过滤除菌的优点是不但能去除微生物，而且不影响溶液中各种热敏性组分的活性15。4.2.1 分批灭菌是将先配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程（适用于小型发酵罐）。4.2.2 连续灭菌是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程。其流程图如图4-1所示。图4-1 连续灭菌的流程图4.3空气除菌大多数好氧微生物生物反应过程一般需要每分钟连续向每立方米发酵桶通入0.51.0m3空气，并且要求通入的空气为无菌空气，具有一定的压力与温度。对此工业上都采用以纤维层为介质的过滤和膜过滤方法处理来自空气压缩机的空气以达到这种要求。过滤是空气除菌的主要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类：绝对过滤，相对过滤。后者主要原理为：1、惯性滞留作用2、拦截滞留作用3、布朗扩散作用4、重力沉降5、静电作用。4.4 发酵罐除菌 发酵罐的空消操作：打开灌顶各排气阀，打开三路进气（罐底、风管、取样管）。通入蒸气，使罐内蒸气压力达0.147MPa，维持45min。灭菌过程从阀门，边阀排除空气，并使蒸气通过达到死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸气后，待管内压力低于空气过滤器时，通入无菌空气保压0.098MPa。实罐灭菌方法是：预热（8090），直热（蒸汽）（120、30min）（全进全出原则），待空气压力高于罐内压力时，通入空气（即待罐内压力降到低于空气压力后导入无菌空气。）5 种子扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。种子制备的工艺流程如图所示： 图5-1 种子制备流程图5.1 实验室种子的制备保藏在沙土管或冷冻干燥管种的菌株经无菌操作接入适合于孢子发芽或菌丝生长的麦芽糖琼脂斜面培养基中，在321，ph值3.5-4.5环境下，经培养成熟后挑选菌落正常的（菌落为白色，无光泽，培养久时，菌落变硬）再一次接入试管斜面。待长出大量菌体后将其转入种子罐扩大培养。5.2 生产车间种子制备 主要设备：一级种子罐，采用100L标准发酵罐一台。二级种子罐，用500L喷雾轮式发酵罐两台。发酵罐2台，其中一台做后熟储罐用。生产车间用种子培养基原则为采用已被菌利用的成分，同时还需供给足够的无菌空气发酵罐培养时根据微生物的生长特性，要注意适当的增减料液中的某些成分以利于发酵向着有利的方向进行。所以在发酵过程中，应根据不同阶段的特点加入不同的物质，以使发酵向着有利的方向进行。斜面种子活化12h-24h一-级种子培养24-36h，活化种子培养48-72h一摇瓶发酵培养打开接种口在火焰保护下接种到3台100L的种子罐中培养，接种量为种子罐内的培养基量的10%，培养13h。其目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分、多含有机氮为主，有利于长菌。一级种子质量要求：种龄：12hpH值：6.40.1光密度：OD净增值0.5以上残糖：0.5以下 无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐培养24小时后接入二级种子罐最后接入发酵罐；二级种子罐的装液、灭菌与发酵与一级种子罐类似。种子罐的体积按照接种量来确定。6 发酵罐的工艺设计酵母培养罐的选择是酵母得率高低的关键之一。酵母发酵是用通风发酵罐，发酵时需将空气不断通入发酵液中，以供微生物所消耗的氧气，使其生长旺盛。本设计采用通用式发酵罐。通用式发酵罐利用机械搅拌的作用，使空气和发酵液充分混合，促使氧气在发酵液中溶解，以保证供给微生物生长、繁殖所需的氧气。6.1 发酵罐的结构通用发酵罐的主要组成部件有：罐体：是发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是使液内充分湍流，使营养物质与菌体接触更充分，一般用3-5块挡板。搅拌装置：主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。搅拌转速为200r/min.传热装置：有夹套，列管等，这里采用外夹套。通气部分：通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵罐通风量0-12 h为1：0.67vvm ,12 h至发酵结束通风量为1：（1.0-1.33）vvm 。分布器有单管式和环形管式。消泡装置：用于消除产生的泡沫，最有效的控制泡沫的方式为添加消泡剂。但是，由于消泡剂大多对菌体生长有抑制作用，故最常选用的简单实用的消泡装置是耙式消泡器，直接装在搅拌轴上，利用机械力量改变泡沫表面张力，达到消泡目的。进出料口：罐顶设有进料口，罐底有出料口。其他附属设备还包括试镜、人孔、取样管等，用以观测和检修。管道系统，包括试镜、取样管、pH值探头、温度探头、溶氧探头等，用以随时观测、调节和检修。发酵罐的管路分布图，见附图6.2发酵罐的工艺尺寸常用的机械通风发酵罐的结构和主要几何尺寸已标准化设计（见附图二）。其几何尺寸比例如下：H0/D=1.73.5 H/D=25 d/D=1/31/2 W/D=1/121/8 B/D=0.81.0 h/D=1/4 单位全部为m发酵罐大小用公称体积表示，V0=D2H/4+0.15D3其中：H0-发酵罐圆柱形筒身高度 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度D-搅拌器直径W-挡板宽度B-下搅拌器距罐底的距离 S-搅拌器间距h-底封头或顶封头高度 6.2.1 发酵罐的工艺计算 年产200吨单细胞蛋白，选工作日为300天，发酵周期为3天。清理及维修发酵罐总时间为1天，则总发酵天数为4天。日产量为约0.67吨=670kg。发酵液预处理收率约为94%，提取时收率约为79%，浓缩干燥收率为95%，装料系数为70%。查得每吨味精废液经发酵后可得到5%-7%饲料酵母25kg12。按半连续方式发酵进行计算。一年需放罐的次数：300/4=75（次）每批次产单细胞蛋白：200/75=2.7（吨）每天生产单细胞蛋白：2.7/3=0.9（吨）每小时生产单细胞蛋白：0.9/24=0.0375(吨)稀释率(D)0.1-1h，即停留时间为:1/0.1=10(h)每吨味精废液经发酵后可得饲料作母25kg，则每小时应从发酵罐中流出发酵液流量为：0.03751000/25=1.5(吨)总提取率为：94%79%95%=70.5%假设用一台发酵罐，则发酵罐的体积V=1.510/70%=21.4m3根据以上计算可以选取25m3。所需发酵罐一个。由V0（公称体积）=Va（筒身容积）+Vb（底部）D2H0/4+0.15D3得：D=2.28m(H0=2.5D)那么：H0=2.5D=2.52.28=5.7m H=3D=32.28=6.84md=D/2=2.28/2=1.14m W=D/12=2.18/12=0.19mB=0.9D=0.92.28=2.05m S=2d =21.14=2.28mh=D/4=2.28/4=0.57m 液面高度HL=0.7(H+h)=0.7(6.84+0.57)=5.19 m H：发酵罐筒身高 D：发酵罐内径d：搅拌器直径 W：档板B：下搅拌浆距底部距离 S：两搅拌浆之间的距离Hl：液位高度 6.2.2物料衡算本系统采用1个发酵罐，每个为25 m3，单细胞蛋白产量为25g/L, 发酵液预处理收率约为94%，提取时收率约为79%，浓缩干燥收率为95%，装料系数为70%。则：每个发酵罐在一个发酵周期单细胞蛋白产量为：25251094%79%95%0.7=3086kg那么1个发酵罐1年的总产量为：308675=231450kg=231.5吨故符合年产量为200吨的生产要求。7 发酵工艺控制167.1发酵过程温度的影响及控制温度对发酵的影响较显著。在2733时。热带假丝酵母菌体密度随温度的升高而增大。在此温度范周内，温度升高使假丝酵母体内的酶系(d一淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖外切酶和葡萄糖内切酶等)处于较活跃的状态，因而各种合成反应的速率加大。有利于菌体生长和产物积累；同时，温度增高易降低发酵液黏度。有利于好氧的热带假丝酵母的大量生长繁殖。但温度过高会导致菌体对氧的消耗相应加快同时氧的溶解度也在下降，转化生成的氨气挥发速度加快；因此，当温度增高超过36时，发酵液菌体密度迅速降低。如图7-1所示：7-1 温度与菌体密度的关系7.2 pH对假丝酵母生长的影响酵母菌是喜酸微生物，适宜的初始pH有助于酵母菌体内酶系的高效运作。改善酵母菌细胞膜的通透性，利于合成代谢的顺利进行。但也有一定的范围，pH太高会加速发酵液内尿素的分解，使养分损失。最终降低饲用蛋白细胞产量，同时增大发酵液受杂菌污染的概率。而pH太低会降低酵母菌酶系活性。影响假丝酵母菌正常生长同时使生产出的饲用蛋白细胞散发过浓的酸味。影响牲畜食欲。图7-2 pH对假丝酵母生长的影响7.3 KH2P04含量对假丝酵母生长的影响钾是生物体内各种重要酶系的激活剂，缺钾将使动物免疫力大大降低并诱发各种疾病，磷元素是构成动植物和微生物细胞膜的主要元素之一。在培养液中添加必要的磷和钾元素，使单细胞饲料的营养构成更合理。试验通过添加一定量的KH：PO。来调节培养基中的磷和钾元素。7.4 氧气对酵母菌生长的影响 本设计需要蛋白酵母菌大量的生长。因此，氧气的多少对酵母菌的生长有重大的影响。在整个的发酵过程中，都要求对酵母菌供应充足的氧气，从而保证菌体良好大量的生长，蛋白质丰富。，在发酵初期，通过增加转速和提高通气量可以让溶氧维持在这一水平以上，而在后期单靠提高转速和通气量已经不能满足溶氧的需求时，可以通过联合控制补料速度的方法来提高溶氧。7.5染菌的控制在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量，重则倒罐或停产，影响工厂效益。因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。8下游加工从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程发酵液8.1预处理和固液分离 微生物发酵液小含有大量的菌体、细胞或细胞碎片、残余的固体培养基以及各种微生物代谢产物，发酵液的过滤与分离相当困难。通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。发酵液预处理和固液分离是下游加工的第一步操作。预处理的目的是改善发酵液性质，以利于固液分离，常用酸化、加热、加絮凝剂等方法进行17。 发酵结束后一般培养液中约含5一10酵母，要在尽可能短的时间内(最好比内)将酵母从培养基内分离出来。因为培养基所含有的酵母代谢产物会影响酵母的品质，所以发酵结束后经一定冷却后要马上进行酵母分离12。该设计采用酵母分离机分离酵母细胞18。尽管采用了高速离心机，但要酵母能经过分离增浓，达到干燥所需要的浓度，一次分离仍然还不行，还要再浓缩多次。国内的酵母工厂，一般是采用单程三级增浓分离工艺，即将含。8.2 提取和干燥分离得到的酵母再用46倍冷水洗涤、分离，迅速冷却(这样可以限制细胞生物量的损失)，得到的酵母浓缩液送至板框式压滤机或圆筒式过滤器中过滤，一般得到65浓缩酵母，最后以30热风干燥至水分约6一8，或通过双滚筒干燥机干燥并制成颗粒状或块状，经真空或充氮气，低温贮藏。整个生产的加工流程如下图：参考文献1 熊加林，张壬行饲料加剂M北京：化学工业出版社，1999256-2572 段永兰.单细胞蛋白和菌体蛋白饲料的生产及发展前景. 畜牧与饲料科学. 2010，31(1112)：44463 高玉荣，刘洋，李大鹏，周川农. 大豆糖蜜高产单细胞蛋白菌株的筛选及其 生长条件.中国酿造,2010年第8期总第221期.4 王红，石宝明. 单细胞蛋白饲料的研究及其在畜禽生产中的应用.综述.5 郑裕同生物加工过程与设备M. 北京.化工出版杜， 20046 刘建静，杨曙明，宋海彬. 单细胞蛋白饲料的开发与利用.黑龙江畜牧兽医2008年第4期7 范淹才，张敬标自地霉和产朊假丝酵母田中国饲料，1997，(7)：38-408 王文仲应用微生物学现代生物技术MI天津：中国医药科技出版社。1996：5589 何海燕，覃拥灵，李楠，李涛. 利用甘蔗糖蜜发酵生产酵母单细胞蛋白的菌种选育.饲料资源开发与利用，2006，No.1210 金新酶，金世芳，王云龙.用连续发酵工艺由味精废液制取单细胞蛋白.微生物学报，31（3）：240-246,199911 赵芸君，桑段疾，贾海涛，刘艳丰. 番茄渣发酵生产蛋白饲料菌种筛选研究. 草食家畜(季刊), 2011年3月第1期(总第150期)12 王定昌. 工业废水生产单细胞蛋白. 1991年12月第1版13 陈合，余建军 ，舒国伟，李世玉，曾杰. 产朊假丝酵母1 80 7高产培养基的优化. 中国调味品, 2010年第7期总第35卷14 杨洁彬，李淑高，周维新等编著食品微生物学北京：北京农业大学出版社，1995，815 储炬. 现代生物工艺学 （下册）. 200816 易弋,黎娅,李伟华,黄翠姬,伍时华. 利用臼酒糟生产蛋臼饲料的研究.华达专栏, 10022813f2009)120027-0317 杨汝德.现代生物科学与生物工程导论. 华南理工大学出版社, 2006年3月