发酵液中溶磷检测规程.doc

发酵液中溶磷检测规程1. 规程内容1.1 原理磷酸或磷酸盐的酸性溶液中与钼酸铵作用生成黄色磷钼酸铵，再用适当的还原剂还原成钼兰进行比色。1.2 试剂与仪器刻度试管：25ml容量瓶：1000ml 100ml移液管：5ml 1ml吸量管：25ml 5ml风光光度计钼酸铵溶液配制：称钼酸铵6g溶于60ml水中（若混过滤）倒入90mlCP浓硫酸与60ml水，冷却摇匀后，贮存于棕色试剂瓶中备用。米土尔（硫酸对甲氨基酚）试剂：称取米土尔0.2g与无水亚硫酸钠1g溶于200ml蒸馏水，待完全溶解后，再加入焦性亚硫酸钠（偏重亚硫酸钠）40g（或酸性亚硫酸钠43.8g）待完全溶解后过滤，滤液贮存于棕色试剂瓶中避光冷藏（有效期一个月左右）。10%三氯醋酸：取50g三氯醋酸倒入500ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。1.3 磷标准曲线绘制：精确称取于105干燥至恒重的磷酸二氢钾 0.4394g，用少量水溶解于1000ml容量瓶中，加入0.05mol/L硫酸20ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀则每毫升含磷100r（此为储备液），再精确吸取5ml100r/ml溶液于100ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸20ml，用蒸馏水稀释至刻度摇匀，则此溶液中每毫升含磷5r，用刻度吸管分别吸取5r/ml的溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml于25ml刻度试管中加入钼酸铵溶液及米土尔溶液各1ml，加蒸馏水至10ml，摇匀后再沸水中煮沸30min，取出冷却至室温，准确以蒸馏水补足至10ml摇匀，在650nm波长处比色，另用试剂作空白对照，以浓度为纵坐标，光密度为横坐标做一曲线，列表备用。1.4 测定方法： 吸取发酵滤液2.5ml于50ml容量瓶中，加入10%三氯醋酸溶液5ml，放置片刻，在沸水中加热10min左右，使蛋白凝固，冷却后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后过滤，吸取滤液1ml于25ml刻度管中，加入钼酸铵溶液及米土尔溶液各1ml加水至10ml摇匀后，在沸水浴中煮沸30min，取出冷却至室温，准确以蒸馏水补足至10ml摇匀，在650nm波长处比色，用试剂为空白，查表乘以稀释倍数（20倍）。 空白：8ml水加1ml钼酸铵和1ml米土尔。1.5 计算：吸样1ml，即为r/ml*20（稀释倍数）1.6 注意事项1.6.1 样品中的磷必须是磷酸形式存在，不能使其它价态，也不能是聚合 状态，因此配制标准溶液时可加入0.05mol/L硫酸。1.6.2 要使一定量的PO43-转变为12钼磷酸，必须有过量的钼酸铵存在（应为在理论量的3.5倍），如钼酸铵不足，过量的PO43-会和已生成的12钼磷酸反应，生成无色的过滤性杂质络合物。1.6.3 12钼磷酸的生成与加入到溶液中酸量有关，酸不足不能定量生成，如加入酸量过多，12钼磷酸又分解，因此显色与ph值关系极大，所以加入试剂量要严格控制。1.6.4 磷试剂更换，要做曲线对照，所有仪器均要清洗干净。1.6.5 三氯醋酸沉淀蛋白质溶液要清。1.6.6 米土尔为硫酸对甲氨基酚。1.6.7 加热过程中，水浴温度均应98。1.6.8 所用比色器皿预先应用蒸馏水校正。1.7 测定允许误差： 2%