胶体金快速免疫诊断技术【研究特选】.ppt
免疫层析快速诊断技术,层析法技术优势:简单现场快速,1.打开包装取出试纸条,2.直接插入待测样品中,3. 目测读出结果（3-10分钟内）,与常规诊断方法相比,技术应用,试纸条组成结构,测试线 （T线）,控制线（C线）,胶体金垫,吸水滤纸,样品垫,NC膜（硝酸纤维素膜）,层析方向,PVC底板,有4个组分：、吸水纸（样品垫）。、玻璃纤维膜（胶体金垫）。膜上吸附着干燥的金标抗体（流动带）。、硝酸纤维素膜，膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。、吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。,基本原理是将已知的特异性抗原或抗体固定于硝酸纤维素膜上某一区带作为检测带，在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现红色条带。如样品中没有待测抗原或抗体，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一般再固定上针对金标结合物相应的抗原或抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示，如无，则检测失败。整个过程一般在15分钟内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。,免疫层析法检测原理分类介绍,胶体金免疫层析法检测流脑抗体（间接法） 胶体金标记的兔抗人IgG，样品中的流脑抗体与胶体金标记的抗人IgG结合，沿硝酸纤维素膜移动，在包被有流脑抗原结合，出现红色反应线。,免疫层析法检测原理分类介绍（双抗体夹心）,（以HCG检测为例）,HCG-亚基抗体Y2，羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上，金标HCG-亚基单抗Y1固定于玻璃纤维素膜上。,免疫层析法检测原理分类介绍（竞争反应）,（以吗啡检测为例）,吗啡偶联物和胶体金标记的抗吗啡单克隆抗体固定于膜上测试区。通过吗啡偶联物和尿液中的吗啡竞争结合金标单克隆抗体，最小检出量300ng/ml。结果判定：阳性（+）：吗啡300ng/ml以上，质控区出现一条紫红色条带，测试区内不出现紫红色条带。吗啡浓度高于300ng/ml时，胶体金抗体与吗啡全部结合，从而不与吗啡偶联物结合而不出现紫红色条带。阴性（-）：吗啡在300ng/ml以下。出现两条紫红色条带，一条在测试区内，另一条在质控区内。吗啡浓度低于300ng/ml时，胶体金抗体不能与吗啡全部结合。这样，胶体金抗体在层析过程中会被固定在膜上的吗啡偶联物结合，测试区内会出现一条紫红色条带。无效：质控区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。,抗体 Antibody,来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐,抗原抗体生物原料,抗原 Antigen,全病毒抗原 重组抗原,胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。,容器硅化处理：玻璃表面少量的污染会干扰胶体金 颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗、硅化。将玻璃容器浸泡于二氯二甲硅烷的氯仿溶液中分钟，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用 。,胶体金的制备,胶体金的制备,枸橼酸三钠还原法 15nm、18nm30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、1820nm、41nm和50nm 颜色与颗粒的关系.最佳标记颗粒大小40nm.,1柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00 金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙 吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518 径粒(nm) 147 97.5 71.5 40 24.5 15,胶体金的鉴定,1. 肉眼观察：在日光下仔细观察胶体金颜色，可以大致估计金颗粒大小。同时良好的胶体金应该是清澈透明的，若浑浊或有漂浮物提示有较多的凝集颗粒。 2. 分光光度计扫描吸收峰时光波长来估计金颗粒的大小。 3. 电镜可见精确测定金颗粒的大小。,免疫胶体金的制备 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。蛋白质的预处理:1.蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在。 2.用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。 3.胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。,蛋白质最适用量测定: 将待标记的蛋白质（鼠抗人IgG）储存液作系列稀释后，分别取0.1ml加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1ml 10NaCl溶液，混匀后静置2小时。,1,2,3,4,5,7,6,胶体金(ml) 1 1 1 1 1 1 1 蛋白质(ug) 0 10 15 20 25 30 35 10%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1,结果判断: 对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变,不稳定的金溶胶将发生聚沉，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。 胶体金与蛋白质偶联后，加入稳定剂，以避免产生凝集。一般选用PEG（分子量为20000）和牛血清白蛋白作稳定剂。加入的量：5BSA使溶液终浓度为1%；1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。,用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH。于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌23分钟。加入5ml1%PEG20000溶液。于10000100000g离心3060分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。将沉淀悬浮于一定体积含0.20.5mg/ml PEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以 A540nm=1.5左右为宜，防腐置4保存。包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。,胶体金蛋白结合物的质量鉴定 平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。 OD520nm值测定：用PBS液（含1%BSA）将胶体金蛋白试剂作1:20稀释，OD5200.25左右。一般应用液的OD520应为0.20.4。 金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。,胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备,胶体金标记的鼠抗人IgG放入玻璃纤维素膜浸泡10分钟，取出至37度烤箱中烤干，热合封口，置4摄氏度冰箱备用。(实验阶段） 用喷点仪将胶体金标记的鼠抗人IgG喷在玻璃纤维素膜上,真空干燥2 h 。 （生产阶段）,选择NC膜,NC膜的选择 爬速(?秒/4cm)对灵敏度的影响 通过同一T线喷点位置时, 金溶液通过的速度是快速膜慢速膜. 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短, 读数快, 那么灵敏度也就越低. 反之, 反应时间长, 读数慢, 也就灵敏度高。 同时还有一个问题是, 反应时间越长, 发生非特异性结合的可能性就越大, 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度.。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡. 不同膜厂家的产品 (Whatman,Millipore,Sartorius) 大致为: 135s和180s,抗原、抗体包被固相NC膜的制备,包被流脑抗原浓度筛选（T线）抗原用PBS 梯度稀释, 释后用1l移液器点在NC 膜上,37 干燥1 h 备用 。 包被抗鼠IgG浓度筛选（C线） 抗鼠IgG抗体用PBS 梯度稀释, 释后用1l移液器点在NC 膜上,37 干燥1 h 备用。,溶液喷点(喷点演示:BIODOT XYZ系列喷点仪器),CT线溶液前处理: 1.过滤,0.22um孔径滤膜 2.离心1万转10分钟 CT线喷点工艺与接触划点工艺比较 因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其表面留下印痕.划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性。,干 燥,干燥方法的比较 37度干燥h：颗粒感较强，易中间白，周边深; 低温真空干燥h：颜色均一，只是两端稍浅，有一定的柔性。,试纸条组装,在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4 mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。,切条包装,切条 (演示:BIODOT CM4000切条机) 包装,质量控制,1特异性 用30份阴性参考血清进行检测，结果不得出现假阳性； 2敏感性 用30份阳性（包括强阳性、中阳性、弱阳性）参考血清进行检测，假阴性率不得超过3份,并用已知抗体效价血清系列稀释测试其最小检出量。 3精密度 观察批间、批内差异，CV（%）应不高于10%。 4稳定性检测 37放置3天，鉴定指标应达到以上标准。,灵 敏 度A/A+C100% 特 异 度D/B+D100% 假阳性率B /B+D100% 假阴性率C /A+C100%,质量评价,谢谢,
