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项目一 产纤溶酶菌株的筛选纤溶酶是大豆发酵过程中由微生物分泌的一种蛋白水解酶，在酶学分类上有些是丝氨酸蛋白酶，有些是金属蛋白酶，具有能直接降解血栓纤维蛋白，并不降解血浆纤维蛋白原，可口服，经消化道直接吸收，安全可靠，在人体内半衰期长，不易引起体内出血等优势，被认为是潜在的、安全的溶栓剂。一、基本原理能够产生纤溶酶的菌株在初筛平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。二、实验目的学习用选择平板分离纤溶酶产生菌的方法，获得产纤溶酶菌株。三、实验器材1. 原料豆豉或纳豆2. 溶液和试剂蛋白胨，牛肉膏，琼脂粉，氯化钠，酪蛋白，营养琼脂，葡萄糖等。3. 仪器和用品三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，培养摇床，高压灭菌锅，天平、振荡混合器四、操作步骤1. 初筛培养基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白2.0，琼脂粉2.02. 菌种保存斜面的配制（%）：葡萄糖0.5，营养琼脂 3.5。分装成若干支试管，试管上带棉塞。（每人3支试管）3. 培养基与器皿（1.5 mL离心管60个，无菌水100 mL）的灭菌121，灭菌15 min4. 菌液的制备分别称取3 g原料于研钵中，加入10 mL无菌水研碎后，转移至无菌离心管中，迷你离心机离心后，将上清液转移至试管中，备用。5. 菌液的梯度稀释与划线移取上述菌液0.5 mL至4.5 mL无菌水中，制成10-1菌液，依次类推，制成10-2，10-3，10-4菌液，分别将10-3，10-4菌液涂布到初筛培养基上，每个梯度涂布2块平板，分别放入28、35培养20 h左右观察结果。用接种环从实验项目一的平板上选择一个能产水解圈的菌株在选择平板上划线分离。（每人划12个平板）6. 产纤溶酶菌株的分离纯化7. 产纤溶酶菌株的菌落形态观察及菌种保存将上述划线后的平板放入37培养箱培养20 h后，将平板拍照，接种其中最为典型的菌株划线保存在试管斜面上；观察产纤溶酶菌株在选择平板上的菌落形态，并对其进行描述。项目二 产纤溶酶菌株的酶活测定一、基本原理1. 不同类型的纤溶酶都能在初筛平板上形成水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是纤溶酶的高产菌株，因此要进行酶活测定复筛。2. 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。二、实验目的学习采用福林试剂测定纤溶酶活力。三、实验器材1. 原料产纤溶酶菌株2. 溶液和试剂蛋白胨，牛肉膏，琼脂粉，氯化钠，干酪素，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，硼砂，酪氨酸，蒸馏水等。3. 仪器和用品三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，高压灭菌锅，天平、振荡混合器四、操作步骤1. 选择平板的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白2.0，琼脂粉2.0，121，灭菌15 min。（200 mL2）预备实验1（杨华、王金新）2. 扩大培养基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白2.0，15150的试管装6 mL，121，灭菌15 min。（150 mL，分装成25支试管，每6 7支一包）预备实验1（杨华、王金新）3. 发酵培养基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，酪蛋白2.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌15 min。（1200 mL，分装成24个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）预备实验1（杨华、王金新）4. 菌液的制备用接种环从试管斜面上挑取一环菌株，在选择平板上划线，37倒置培养20 h，挑选有明显水解圈的单菌落转接入试管扩大培养液中37震荡培养6 h，转接入装有50 mL发酵培养基的三角瓶中继续37震荡培养16 h，4，5000 rpm离心10 min，取上清液用于纤溶酶活力的测定。5. pH7.2磷酸缓冲液的制备 预备实验2（邓海、张娟）取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸馏水稀释1倍，即为pH7.2磷酸缓冲液。A液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）称取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）称取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。 6. Folin试剂的配制 预备实验2（邓海、张娟）6.1 Folin试剂在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g钨酸钠，5 g钼酸钠及140 mL蒸馏水，再加10 mL85%磷酸，20 mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流结束时，加入30g 硫酸锂，10 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。转移至200mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤回流瓶，洗涤液一并转移至200mL容量瓶，定容至200 mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。6.2 Folin试剂使用液使用前，将Folin试剂与水按1:2稀释。7. 0.4 mol/L碳酸钠溶液的配制 预备实验3（瞿格格、喻顺华）准确称取无水碳酸钠42.4 g，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。8. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 预备实验3（瞿格格、喻顺华）准确称取65.4三氯乙酸，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。9. 0.5 mol/L的NaOH的配制 预备实验3（瞿格格、喻顺华）准确称取2 g NaOH溶解并定至100 mL。10. 20.00 mg/mL干酪素溶液 预备实验3（瞿格格、喻顺华）称取干酪素2.000 g，准确至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2 3滴)润湿，加入约80 mLpH7.2磷酸缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存。11. 100 g/mL酪氨酸标准溶液 预备实验3（瞿格格、喻顺华）准确称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，用1 mol/L的盐酸60 mL 溶解后定容至100 mL，即为1.00 mg/mL的酪氨酸溶液。吸取1.00 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得100.0 g/mL L-酪氨酸标准溶液，此溶液在冰箱内贮存。12. 酪氨酸标准曲线的制作用100 g/mL酪氨酸标准溶液配制0100 g/mL的标准溶液。试管号012345取 100 g/mL 酪氨酸溶液（ mL ）0246810蒸馏水（ mL ）1086420酪氨酸实际浓度（g/mL ）020406080100取上述不同浓度的酪氨酸1 mL与5 mL 0.4 mol/L Na2CO3、1 mL Folin试剂混合，40 水浴显色30 min，680 nm测定吸收值并绘制标准曲线。试管号012345取不同浓度的酪氨酸溶液（ mL ）10.4 mol/L Na2CO3（ mL ）5Folin试剂140 水浴显色30 min取出用分光光度计于波长680 nm比色，以不含酪氨酸的0管为空白调零，分别测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数K值，其K值应在95100范围内。 13. 样品测定 13.1 先将干酪素溶液放入400.2恒温水浴中，预热5 min。13.2 取4支试管，各加入1 mL酶液。13.3 取一支作为空白管，加2 mL三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1 mL干酪素，摇匀，40保温10 min。13.4 取出试管，3支测试管中各加入2 mL三氯乙酸，空白管中加1 mL干酪素。 13.5 静置10 min，使蛋白质完全沉淀，然后用滤纸过滤沉淀。13.6 各取1 mL滤液，分别加0.4 mol/L的 Na2CO3 5 mL、Folin试剂1 mL。在40显色30 min。680 nm处测OD值。 以空白管调零点。 五、结果计算 1. 酶活定义 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在40（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1 min水解干酪素产生1 g酪氨酸为一个酶活力单位。 2. 计算酶的活性单位依据以下公式 蛋白酶的活力= AK4/10n U/g(mL) A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 10：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数项目三 碳源对菌株产纤溶酶活力的影响一、实验材料1. 实验原料：高产豆豉纤溶酶菌株2. 试剂：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂粉、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、麦芽糖、甘露糖、果糖、甘露醇、玉米淀粉、大豆粉、四棱豆粉，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，蒸馏水等。3. 器皿：三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，高压灭菌锅，天平、振荡混合器、具塞比色试管等。4. 仪器设备：分光光度计、灭菌锅。二、实验操作步骤1. 培养基制备（1）选择平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，干酪素 2.0，琼脂粉2.0，121，灭菌20 min。预备实验（刘炎平、申超凡）（2）扩大培养基的配制（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，氯化钠0.5，15150的试管装6 mL，121，灭菌20 min。预备实验1（刘炎平、申超凡）（3）发酵培养基1的配制（%）：葡萄糖2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（4）发酵培养基2的配制（%）：蔗糖2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5， 250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（5）发酵培养基3的配制（%）：可溶性淀粉 2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（6）发酵培养基4的配制（%）：干酪素 2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（7）发酵培养基5的配制（%）：玉米淀粉2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（8）发酵培养基6的配制（%）：麦芽糖2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（9）发酵培养基7的配制（%）：甘露醇2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（10）发酵培养基8的配制（%）：糊精2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（11）发酵培养基9的配制（%）：果糖2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（12）发酵培养基10的配制（%）：四菱豆粉2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（13）发酵培养基11的配制（%）：大豆粉2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）2. Folin试剂的配制 2.1 Folin试剂在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g钨酸钠，5 g钼酸钠及140 mL蒸馏水，再加10 mL85%磷酸，20 mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流结束时，加入30g 硫酸锂，10 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。转移至200mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤回流瓶，洗涤液一并转移至200mL容量瓶，定容至200 mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。2.2 Folin试剂使用液使用前，将Folin试剂与水按1:2稀释。3. 0.4 mol/L碳酸钠溶液的配制 准确称取无水碳酸钠42.4 g，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 准确称取65.4三氯乙酸，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。5. 0.5 mol/L的NaOH的配制 准确称取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. pH7.2磷酸缓冲液的制备 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸馏水稀释1倍，即为pH7.2磷酸缓冲液。A液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）称取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）称取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制备 预备实验（刘炎平、申超凡）称取干酪素2.000 g，准确至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2 3滴)润湿，加入约80 mLpH7.2磷酸缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存。8. 粗酶液的制备用接种环从试管斜面上挑取一环菌株，在选择平板上划线，37倒置培养20 h，挑选有明显水解圈的单菌落转接入试管扩大培养液中37震荡培养6 h，按2%的比例分别转接入装有50 mL不同发酵培养基的三角瓶中（3瓶）继续37震荡培养20 h，4，5000 rpm离心10 min，收集上清液为粗酶液。9. 酶活的测定取粗酶液1mL，按照福林试剂法测定其纤溶酶活力，研究碳源对产酶的影响，通过酶活力确定最佳碳源。项目四 氮源对菌株产纤溶酶活力的影响一、实验材料1. 实验原料：高产豆豉纤溶酶菌株2. 试剂：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、干酪素、琼脂粉、葡萄糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏(粉)、牛肉膏(粉)、干酪素、硝酸钾、硝酸铵、脲素、硝酸钠，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，蒸馏水等。3. 器皿：三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，高压灭菌锅，天平、振荡混合器、具塞比色试管等。4. 仪器设备：分光光度计、灭菌锅。二、实验操作步骤1. 培养基制备（1）选择平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，干酪素 2.0，琼脂粉2.0，121，灭菌20 min。预备实验（邹白玲、黄云虹）（2）扩大培养基的配制（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，氯化钠0.5，15150的试管装6 mL，121，灭菌20 min。预备实验1（邹白玲、黄云虹）（3）发酵培养基1的配制（%）：最优碳源 2.0，蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（4）发酵培养基2的配制（%）：最优碳源 2.0，大豆蛋白胨2.0，氯化钠0.5， 250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（5）发酵培养基3的配制（%）：最优碳源 2.0，胰蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（6）发酵培养基4的配制（%）：最优碳源 2.0，酵母膏(粉)2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（7）发酵培养基5的配制（%）：最优碳源 2.0，牛肉膏(粉)2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（8）发酵培养基6的配制（%）：最优碳源 2.0，干酪素2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（9）发酵培养基7的配制（%）：最优碳源 2.0，硝酸钾2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（10）发酵培养基8的配制（%）：最优碳源 2.0，硝酸铵2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（11）发酵培养基9的配制（%）：最优碳源 2.0，脲素2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（12）发酵培养基10的配制（%）：最优碳源 2.0，硝酸钠2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（13）发酵培养基11的配制（%）：最优碳源 2.0，大豆蛋白胨1.0，牛肉膏 1.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）2. Folin试剂的配制 2.1 Folin试剂在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g钨酸钠，5 g钼酸钠及140 mL蒸馏水，再加10 mL85%磷酸，20 mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流结束时，加入30g 硫酸锂，10 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。转移至200mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤回流瓶，洗涤液一并转移至200mL容量瓶，定容至200 mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。2.2 Folin试剂使用液使用前，将Folin试剂与水按1:2稀释。待添加的隐藏文字内容13. 0.4 mol/L碳酸钠溶液的配制 准确称取无水碳酸钠42.4 g，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 准确称取65.4三氯乙酸，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。5. 0.5 mol/L的NaOH的配制 准确称取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. pH7.2磷酸缓冲液的制备 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸馏水稀释1倍，即为pH7.2磷酸缓冲液。A液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）称取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）称取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制备 预备实验（邹白玲、黄云虹）称取干酪素2.000 g，准确至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2 3滴)润湿，加入约80 mLpH7.2磷酸缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存。8. 粗酶液的制备用接种环从试管斜面上挑取一环菌株，在选择平板上划线，37倒置培养20 h，挑选有明显水解圈的单菌落转接入试管扩大培养液中37震荡培养6 h，按2%的比例分别转接入装有50 mL不同发酵培养基的三角瓶中（3瓶）继续37震荡培养20 h，4，5000 rpm离心10 min，收集上清液为粗酶液。9. 酶活的测定取粗酶液1mL，按照福林试剂法测定纤溶酶活力，研究氮源对产酶的影响，通过酶活力确定最佳氮源。项目五 正交实验优化无机盐对菌株产纤溶酶活力的影响一、实验材料1. 实验原料：高产豆豉纤溶酶菌株2. 试剂：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、干酪素、琼脂粉、葡萄糖、胰蛋白胨、K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaC12，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，蒸馏水等。3. 器皿：三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，高压灭菌锅，天平、振荡混合器、具塞比色试管等。4. 仪器设备：分光光度计、灭菌锅。二、实验操作步骤1. 选择平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，干酪素 2.0，琼脂粉2.0，121，灭菌20 min。预备实验（周维、丁超）2. 扩大培养基的配制（%）：葡萄糖1.0，胰蛋白胨1.0，氯化钠0.5，15150的试管装6 mL，121，灭菌20 min。预备实验1（周维、丁超）3. L9(34)正交实验因素水平表K2HPO4(%)KH2PO4(%)MgSO4(%)CaC12(%)10.050.050.025020.10.10.050.0230.150.150.0750.044. L9(34)正交实验设计表K2HPO4(%)KH2PO4(%)MgSO4(%)CaC12(%)11(0.05)1(0.05)1(0.025)1(0)21(0.05)2(0.1)2(0.05)2(0.02)31(0.05)3(0.15)3(0.075)3(0.04)42(0.10)1(0.05)2(0.05)3(0.04)52(0.1)2(0.1)3(0.075)1(0)62(0.1)3(0.15)1(0.025)2(0.02)73(0.15)1(0.05)3(0.075)2(0.02)83(0.15)2(0.1)1(0.025)3(0.04)93(0.15)3(0.15)2(0.05)1(0)5. 发酵培养基的制备（1）培养基1(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.025，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（2）培养基2(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.05，CaC12 0.02，250 mL三角瓶装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（3）培养基3(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.3，MgSO4 0.075，CaC12 0.04，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（4）培养基4(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，CaC12 0.04，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（5）培养基5(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.075，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（6）培养基6(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.3，MgSO4 0.025，CaC12 0.02，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（7）培养基7(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.3，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.075，CaC12 0.02，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（8）培养基8(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.3，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.025，CaC12 0.04，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（9）培养基9(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.3，KH2PO4 0.3，MgSO4 0.05，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（10）发酵培养基10的配制（%）：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（11）培养基11(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏 0.5，氯化钠0.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。2. Folin试剂的配制 2.1 Folin试剂在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g钨酸钠，5 g钼酸钠及140 mL蒸馏水，再加10 mL85%磷酸，20 mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流结束时，加入30g 硫酸锂，10 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。转移至200mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤回流瓶，洗涤液一并转移至200mL容量瓶，定容至200 mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。2.2 Folin试剂使用液使用前，将Folin试剂与水按1:2稀释。3. 0.4 mol/L碳酸钠溶液的配制 准确称取无水碳酸钠42.4 g，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 准确称取65.4三氯乙酸，以蒸馏水溶解定溶至1000 mL。5. 0.5 mol/L的NaOH的配制 准确称取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. pH7.2磷酸缓冲液的制备 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸馏水稀释1倍，即为pH7.2磷酸缓冲液。A液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）称取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）称取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制备 预备实验（周维、丁超）称取干酪素2.000 g，准确至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2 3滴)润湿，加入约80 mLpH7.2磷酸缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存。配制2瓶，各100 mL。8. 粗酶液的制备用接种环从试管斜面上挑取一环菌株，在选择平板上划线，37倒置培养20 h，挑选有明显水解圈的单菌落转接入试管扩大培养液中37震荡培养6 h，按2%的比例分别转接入装有50 mL不同发酵培养基的三角瓶中（3瓶）继续37震荡培养20 h，4，5000 rpm离心10 min，收集上清液为粗酶液。9. 酶活的测定取粗酶液1mL，按照福林试剂法测定纤溶酶活力，研究各培养基中纤溶酶活力的大小，确定最佳无机离子。项目六 起始pH对菌株产纤溶酶活力的影响一、实验材料1. 实验原料：高产豆豉纤溶酶菌株2. 试剂：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、干酪素、琼脂粉、葡萄糖、胰蛋白胨，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，Folin试剂，蒸馏水等。3. 器皿：三角瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，高压灭菌锅，天平、振荡混合器、具塞比色试管等。4. 仪器设备：分光光度计、灭菌锅。二、实验操作步骤1. 选择平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化钠0.5，干酪素 2.0，琼脂粉2.0，121，灭菌20 min。预备实验（刘雅丽、李艳梅）2. 扩大培养基的配制（%）：葡萄糖1.0，胰蛋白胨1.0，氯化钠0.5，15150的试管装6 mL，121，灭菌20 min。预备实验1（刘雅丽、李艳梅）3. 1 mol/L HCl 50 mL预备实验1（刘雅丽、李艳梅）4. 1 mol/L NaOH 50 mL预备实验1（刘雅丽、李艳梅）5. 发酵培养基1的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的盐酸溶液调pH 至4.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）4. 发酵培养基2的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的盐酸溶液调pH 至5.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（3）发酵培养基3的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的盐酸溶液调pH 至5.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（4）发酵培养基4的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的盐酸溶液调pH 至6.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（5）发酵培养基5的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的盐酸溶液调pH 至6.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（6）发酵培养基6的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的NaOH溶液调pH 至7.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（7）发酵培养基7的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的NaOH溶液调pH 至7.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（8）发酵培养基8的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的NaOH溶液调pH 至8.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（9）发酵培养基9的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的NaOH溶液调pH 至8.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（10）发酵培养基10的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的NaOH溶液调pH 至9.0，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（11）发酵培养基11的配制（%）：经前几次实验优化后的培养基，用1mol/L的NaOH溶液调pH 至9.5，250 mL三角瓶的装瓶量为50 mL，121，灭菌20 min。（150 mL，分装成3个250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）2. Folin试剂的配制 2.1 Folin试剂在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g钨酸钠，5 g钼酸钠及140 mL蒸馏水，再加10 mL85%磷酸，20 mL浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流结束时，加入30g 硫酸锂，10 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15 min，以便驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。转移至200mL容量瓶，用少量蒸馏水洗涤回流瓶，洗涤液一并转移至200mL容量瓶，定容至200 mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。2.2 Folin试剂使用液使用前，将Folin试剂与水按1:2稀释。3. 0.4 mol/L碳酸钠溶液的配制 准确称取无水碳酸钠42