荧光定量PCR原理.pdf

荧光荧光 PCR 原原理理 荧光探针与荧光引物 上个世纪 90 年代原美国 Perkin Elmer( PE)公司开发出了 Taqman 荧光探针定量技术，将定量 PCR 带 入了更广阔的应用空间。Taqman 探针法的出现是定量 PCR 技术的重要里程碑，之后在此基础上发 展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量 PCR 技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。 要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到 一定距离(110 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光 强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的 重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量 PCR 所涉及 的荧光探针和荧光引物的检测都这个 FRET 原理相关。实时荧光 PCR 中另一个很重要的概念，即 Ct 值.C 代表循环(Cycle)，T 代表阈值(Threshold).Ct 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值 时所经历的循环数.。一般取 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺 省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始 拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标 准曲线.因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 一：水解探针法 TaqMan 技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan 探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针 （通常 2030bp），探针上 5端和 3端分别标记了一个报告荧光基团（供体）和一个淬灭荧光基团 （受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所 以此时检测不到供体荧光信号；而当 PCR 过程中 TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时， 其 5-3核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针 5端的报告基团游离的报告基团远离 淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每 扩增一条 DNA 链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实时监控 PCR 的过程，准确定量 PCR 的 起始拷贝数。但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团 也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高 MGB 技术 原理：针对 Taqman 探针荧光淬灭不彻底的问题，2000 年美国 ABI 公司推出了一种新 TaqMan 探 针MGB 探针（minorgroove binder oligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)，3端采用了非荧 光性的淬灭基因淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外， MGB 探针的 3端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)，可 以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针 Tm 值, 使较短的探针同样能达到较高的 Tm值而短探 针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一个 15bp 的 MGB 探针的信噪比大于 6,优于理想状态下的 25bp 的普通 Taqman 探针（信噪比约为 1.5）。 允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。有实验证明 MGB 探针对于等位基因的区分比较 理想，甚至可以检测单碱基突变(因为碱基错配对较短探针的杂交稳定性影响更大)水解探针之所以 称之为水解，主要是因为它利用的是 Taq 酶的水解作用，使得探针上的荧光报告基团远离淬灭基团 而发光信号，游离的报告基团数目对应 PCR 新扩增产物，此方法检测的是积累荧光。 优点： 灵敏，特异性高：具有模版序列特异的 Taqman 探针在引物特异的基础上进一步提高的定量 PCR 的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果， 非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择， 使得 Taqman 探针法可以实现在同一管内检测多重 PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光 染料对 PCR 反应的影响 缺点：探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高 此外，也有人认为，Taqman 法利用了 Taq 酶的外切活性，而由于各家公司出产的 Taq 酶对于 其外切酶活性并没有做出严格的活性标定，定量 PCR 的效率有可能受酶外切活性的影响，酶活性 差异也给定量带来了不确定性。至少，生物通定量 PCR 技术系列前面介绍的 Stratagene 2100 万美 元专利之争的 Fullvelocity DNA 聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于 Taqman 探针法了！ 应用：Taqman 技术广泛应用在人类传染病诊断和病原定量上，在动物疾病病原体基因的检测、 畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定以及在疫苗效力测定上等方面都有成功的许多例子。 注意：1) 探针长度应在 15-45bp（最佳 20-30bp)左右，以保证结合的特异性。2) GC 碱基含量 在 40%-60%，避免单核苷酸序列的重复。3)避免与引物发生杂交或重叠。 4)探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的 Tm值要比引物的 Tm值至少高出 5。另外，探针的浓度，探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验 结果有影响。另外，在仪器的选择上也要注意，尽量选择具有 4 色或以上的荧光检测通道的仪器， 已保证你的机器的适用性和试剂选择的灵活性。毕竟技术是在快速发展的。 二：杂交探针法 FRET 技术 原理：罗氏专利的 FRET 探针又称为双杂交探针，或者 LightCycle 探针。FRET 探针由两条和模版 互补、且相邻的特异探针组成（距离 1 5bp），上游探针的 3端标记供体荧光基团，相邻下游探 针的 5端标记 Red 640 受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和 Red640 受体基团紧密相邻（距离 15bp），激发供体产生的荧光能量被 Red640 基团吸收，使得检测探头 可以检测到 Red640 发出波长为 640 的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到 640 波长的荧光。 FRET 探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的 数量，非累积信号，可以用于做 Tm曲线和 SNP 检测。常用的受体荧光基团除了 LC-Red640 还有 LC-Red705。两个单标记探针的长短不影响信号的传递，而探针间的距离通常为 1-5bp（虽然越短 越好，还是要留点空间避免相互之间的反应）。 我们前面提到，Taqman 水解探针法中，一但报告基团水解离开淬灭基团，就一直游离于反应体系 中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的。杂交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到 模板上，相互靠近而产生检测信号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号， 是可逆的，所以可以进行熔解曲线的分析，还可以用于进行突变分析，SNP 基因分型以及产物鉴别。 比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以很快分析出来，这也是 Taqman 法无法做 到的。另外，由于采用 2 条模版特异的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特 异产物的影响。 Fret 探针法由于需要合成 2 条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合成的成 本会比较高，也比较麻烦。但实际上，Fret 探针的设计其实比 Taqman 探针容易，因为 Taqman 探 针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离 远而使得荧光共振能量传递的效率降低，淬灭不彻底。Fret 探针就不受这个限制。不管怎么说，多 数人还是习惯认为单探针比合成 2 条探针要简单。在水解和杂交探针技术之间产生另外一种技术： 分子信标（分子信标产生时间是 1996 年） 分子信标技术 原理：分子信标（ Molecular beacon，MB）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端 的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团 被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分 子信标的茎环结构中，环一般为 15-30bp（有人认为 18-20 个 bp 较好）长，并与目标序列互补，茎 一般 5-7bp 长（GC 含量较高），相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂 则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环 双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状， 使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激发光子。 应用：应用于基因定量分析和突变体识别、疾病基因检测与诊断、单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism , SNP) 分析等生物医学基础和临床研究中。 优点：本底低，特异灵敏 缺点：杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差。 探针合成时标记较 复杂 延伸技术：建立在分子信标技术基础上的探针技术有 Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、 Scorpion 等，其中 Sunrise 技术，这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此荧 光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是其致命的不足。 Amplisensor 技术是一种复合探针 技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一淬灭物。两探针长度不同，其中淬灭物标记探 针 5端多出 7 个碱基（GCGTCCC）。PCR 扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式 PCR 引物连接， PCR 引物的 5末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探 针引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从而释放出淬灭探针部分，破坏了 FRET，而产生荧 光。 Scorpion 技术（蝎形引物）则是通过在分子信标的 3端设计连接臂连接一段引物，使 PCR 延伸 反应时不能够延伸至分子信标，这样非特异扩增产物便无荧光信号。包含发夹结构的 PCR 产物在 退火时形成分子内杂交，发夹结构被破坏，两个基团之间发生荧光共振能量转移，从而发出荧光。 这种方法可以解决非特异的问题，同时灵敏度高，反应快，已应用于 k-ras 及 BRAC2 基因的突变分 析了，但这种方法不能保证杂交时探针与模板完全匹配，而且合成复杂。 这种技术虽然也是积累荧光（因为结合上模板以后不会掉下来），但是不同于 Taqman 水解探针， 分子信标可以进行溶解曲线分析，这也就是说分子信标可以进行包括突变检测，SNP 检测等在内的 定量 PCR 延伸应用。但是这种技术正如上面提到的探针设计复杂，稳定性差而这一点对于溶 解曲线的影响颇大，因此在应用上也需要审慎考虑。 第三代：荧光引物 Amplifluor 技术 原理：激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性 Amplifluor 引 物包含一个 5内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮- 苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的 3端序列是目标特异性引物区。未结合的 Amplifluor 引物由于内 部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。在第一个循环中，Amplifluor 引物 1 与 特异 CDNA 的第一条链退火并被 Taq 酶延伸。在第二个循环中 Amplifluor 引物 1 延伸产物作为引物 2（反义链引物）的模板。一旦引物 2 被 Taq 酶延伸，Amplifluor 发夹引物解折叠并产生荧光信号。 随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。 LUX 技术 原理：LUM(light upon extention) 引物技术是 Invitrogen 公司的一项专利，是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。使用类似 分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个引物 3端用荧光 报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板 存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用 LUX 引物，不需要专门设 计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性，因此他的特异性 要弱于探针技术，但非特异性扩增或引物二聚体没有影响，所以其特异性要强于 SYBR GREEN。 SYBR GREENFRET 探针 Taqman 分子信标 LUX 引物性质可逆荧光积累荧光熔点分析能不能特异 性引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）引物2 探针引物探针引物探针引物（非特异性 扩增或引物二聚体无影响）探针不需要通用性