分子实验室、细胞实验室常用配方.docx

分子实验室、细胞实验室常用配 方2（一）WB 相关试剂及常用缓冲液l RIPA（100mI）（最后要调 pH为7.4）终浓度Tris-HCI(pH7.4 50m分子量 称取121.14 605.7mg)NaCITritonX-100 脱氧胆酸钠M150mM1%1%58.44876.6mg1mI1gEDTA1 mM 292.24 29.2248m8gSDSPMSF（100mM）0.1%0.1g使用时每1ml加10ull 10%过硫酸铵溶液 AP（分装保存于-20 度）AP 粉末 1gddH 0 10ml2l 10SDS（十二烷基硫酸钠）：SDS 粉末 10gddH 0 定容到 100ml223注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡l 6X 蛋白质 sample bufferTris-HCl(1M,pH6.8)30mLSDS甘30mL10g油DTT（154.25 ） 9.3g溴酚蓝0.06gdd H 02容至 100mLl 10XPBS 缓冲液的配制：NaCl 80gKCl 2g定Na HPO2414.4g（十二水合36g）KH PO 0 2.4g2 4加 800 mLddH O,根据开始的 pH 用 NaOH 或 HCL 调2pH 到 7.4，调好 pH 再定容到 1 升。配好后用高 压蒸气灭菌后常温保存最好是在 4 度34l PBST(1X)PBS(1X) 500mlTween 20 500 ll 50Tris- 乙酸（TAE）缓冲液配制 1L 溶液各 成分的用量Tris 粉末 242g冰醋酸 57.1mlNa EDTA2H O 37.2g2 2ddH 0 定容到 1L2l 封闭液脱脂奶粉 5g叠氮钠 0.02g( 现 配现用时可不加)PBS100mLl 染色液(室温)1L 500ml 200ml 100ml定容到甲醇 500mL 25010050乙酸 100502010R250 考马斯亮蓝mL0.5g 0.25 0.1 g 0.0545H 02400g200 80g40lmL脱色液：(室温)1 醇 165mL2 酸 50 mLH 0 785 mL2l 8.8Buffer: （调 pH 至 8.8,4 度保存）Tris10%SDS100ml18.17g4mL200ml36.34g8mlddH 02定 容 至 200ml100mLl 6.8 Buffer: （调 pH 至 6.8,4 度保存）Tris10%SDS100ml606g4mL200ml12.12g8mlddH 02定 容 至 200ml100mL56l 转移缓冲液（10trans buffer ）：（常温保 存）1L 2L甘氨酸 144g 288gTris 粉 30.3g 60.6末ddH 02定容至定容至1L 2L使用时甲醇 200mL 转移缓冲液（10） 100 mL ddH 0 700 mL2l 电泳缓冲液（10）(running buffer) ：（常 温保存）1L 2L甘氨酸 144g 288gTris 粉 30.3g 60.6末SDS 10g 20gddH 02定容至定容至1L 2Ll 10)TBS: （常温保存）NaCl 80.0g67Tris 粉末 24.2gddH 02定容至 1Ll TBST(1X)TBS(1X) 500mlTween 20 500 ll Stripping buffer( 可反复利用 ) 温老师组配 方10%SDS 10ml-巯基乙醇 350 lTris-HCI（pH6.8 ） 6.25ml（6.06 加到 50mL 水）加入 ddH O2至 50mLl Stripping buffer( 可反复利用 ) 郭老师给配 方甘氨酸 15gSDS 1gTween20 1mldd ddH O 1L2作这个 buffer 洗 20min ，然后用 PBST 洗 3 次， 再重新封闭孵抗体。7889（二）细胞和细菌培养基、抗生素 l LB 培养基(当天灭菌后放 4 度存放)1000ml 500ml 300 ml 250 ml 200 ml氯 化 10g5g3g2.5g2g钠蛋 白 10g5g3g2.5g2g胨酵 母 5g2.5g1.5g1.25g 1g提 取物ddH 02定容至 定容至 定容 定容至 定 容1000ml 500ml至300ml250ml至200mll LB 平板：（当天灭菌后倒平板，放 4 度存放）1000ml 500ml 300ml250 ml 200 ml氯 化 10g 5g3g2.5g 2g910钠蛋 白 10g胨酵 母 5g5g2.5g3g 2.5g 2g1.5g 1.25g 1g提 取物琼脂 15g 7.5g 4.5g 3.725g 3gddH 02定容至 定容至 定 容 定容至 定 容1000ml 500ml至300ml250ml至200mlSOB 培养基将下列组分溶解在 0.9L 水中：蛋白胨20g酵母提取物 5g氯0.5g化钠1mol/L2.5ml氯 化 钾用水补足体积到 1L。分成 100ml 的小份，高压 灭菌。培养基冷却到室温后，再在每 100ml 的小1011份中加 1ml 灭过菌的 1mol/L 氯化镁l 1M IPTG（异丙基硫代 -D- 半乳糖苷（分子 量为 238.3 ）溶液IPTG 粉末 2.383gddH 0 定容到 10ml用 0.22m 滤器过滤2 除菌，分装成 1ml 小份贮存 于-20。l Amp+(50mg/ml)Amp+粉末 50mgddH 0 1ml注意：分装保存于-20 度，使用时按 1000 ：1 的 比例用l Kana+(50mg/ml)Kana + 粉末 50mgddH20 1ml注意：分装保存于-20 度，使用时按 1000 ：1 的 比例用l 胰酶：抽滤，长期保存可放负 20 度粉末 0.25gEDTA 0.02-0.03g1XPBS 100mll 高糖 DMEM 培养基：抽滤保存在 4 度粉末全部碳酸氢钠 3.7gddH 02调 pH 值到：7.2-7.4 ）定容到 1L（用盐酸1112l G418 母液（100mg/ml ）用 0.22 mM 滤菌，分装 存于-20 度粉末 1gPBS 10mll zeocin 母液（100mg/ml ）用 0.22 mM 滤菌，分 装存于-20 度粉末 1gddH2O 10mll Blasticidin（100mg/ml ）用 0.22mM 滤菌，分 装存于-20 度粉末 0.3gPBS 10ml1213（三）利用 His-tag 从细菌中纯化蛋白配方 透析液配方终浓度母液浓 量 取 体Tris-HCl(pH:8.0) 20mM13度1M积20ml溶解14NaClMgCl220mM2mM4M1M5 ml2 mlDTT1mM1M1ml甘油ddH O250%500472mlmll超声裂解液(lysis buffer)：2011 年做蛋白纯化时用Na PO （164） 8.2g （50mM）3 4NaCl (58.5) 17.55g （300mM）加 800 mL ddH O 溶解，用 2M NaOH 或者22M HCL 调 pH 到 8.0，再定容到 1 升。配好后用 高压蒸气灭菌后常温保存。洗涤液(wash buffer)l：2011 年做蛋白纯化时用Na PO348.2g（50mM ）NaCl 17.55g （300mM ）咪唑 0.681g （10mM）加 800 mLddH O ,根据开始的 pH 用 2M NaOH 或2者 2M HCL 调 pH 到 8.0，调好 pH 再定容到 1 升l 洗脱液(elution buffer)：2011 年做蛋白纯化时用14溶解15Na PO348.2g（50mM ）NaCl 17.55g （300mM）咪唑 17.025g （250mM） 加 800 mLddH O ,根据开始的 pH 用22MNaOH 或者 2M HCL 调 pH 到 8.0，调好 pH 再定容到 1 升）PrepEaseHistidine-Tagged Protein Purication Kits - High Speci cityl 8X LEW Buffer (Lysis-Equilibrium-Wash Buffer) ：（室温保存）pH：8.0NaH PO .2H O 6.2404g （400mM） 2 4 2NaCl 14.0256g（2.4M）dH 02定容到 100 mL（调节 pH：8.0）l 4X Elution Buffer ：（室温保存）pH：8.0NaH PO .2H O 3.1202 g 2 4 2（200mM ）NaC l7.0128g（1.2M ）咪唑 6.81 g （1M） 1516dH 02（调节 pH：8.0）l EDTA: （100mM）定容到 100 mLEDTA 2.923 gdH 02定容到 100 mLl NiSO :4NiSO4.6H O 2.6285g2（100mM ）dH 02定容到 100 mLl 溶菌酶：（使用时 1ml 溶液加入 20ul） 粉末 50 mgddH20 1mL16171718(四)利用 His-tag 从细胞中富集蛋白配方l 磷酸钠缓冲液按图示比例混合0.2 M Na HPO 溶液和0.22 4MNaH PO 溶液，得到两种缓冲液， pH分别调节成 2 4为8.0 和6.3.pH0.2 M Na HPO 体积 0.2 MNaH PO 体积2 4 2 46.38.0/mL11.2547.35/mL38.752.65l 细胞裂解液(最好新鲜配制，当天使用 )Cell终配配配配配lysisbuffer浓 10ml 15ml 20ml 40ml 30ml 度盐酸胍(g)6M5.73188.597711.463622.927217.19541819Tris(g) 1 0.01 0.01 0.02 0.04 0.030 2114 8171 4228 8456 6342 mMpH8.0buffer(ml)100mM5 7.5 10 20 15（注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓 冲液pH必须8.0!）（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从 树脂上的洗脱）本实验的所有试剂中 EDTA浓度不得超过1 mM,DTT 浓度不超过5 mM，巯基乙醇浓度不超过20 mM。pH 8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）pH 8.0 的终浓配配配配配wash度 100 50m 20ml 40ml 30mlbuffermll1920Urea 尿素(g)8M 48. 24. 9.60 19.2 14.4 048 024 96 192 144Tris(g) 10 mM 0.1 0.0 0.02 0.04 0.03211 605 4228 8456 6342 4 7pH8.0Na PO34100 50 25 102015buffer(ml) mMTriton0.1% 100 50 204030X-100(ul) (vol/vol)b-mercapto 5 mM 35 17.7 14 10.5ethanol. 巯 基乙醇(ul)5pH 6.3 wash buffer ( 现配现用)pH 6.3 的终浓 100配配pH 6.3 的wash度ml 50m 30mwashbufferllbufferUrea 尿素(g)Tris(g)8M 48. 24. 14.048 024 414410 0.1 0.0 0.020Urea 尿素(g)Tris(g)21mM 211 605 36347 42pH6.3Na PO3100 50 25 15 pH6.3Na3PO4buffer(ml)TritonmM0.1% 100 50 304buffer(ml)TritonX-100(ul) (vol/vol)X-100(ul)注意使用pH为6.3的磷酸缓冲液，而且pH不得低 于6，pH要精确配制，非常重要！Histidine的质 子化，会导致镍树脂上的解离，所以要精确测定 pH，并且以pH试纸校对，而不是仅仅依靠 pH仪 器。洗脱溶液200mMImidazole咪唑，5% (wt/vol)SDS，150mM Tris-HCl(pH 6.7) 30% (vol/vol)丙三醇 720mM巯基乙醇21220.0025%(wt/vol)溴酚蓝注意wt/vol是质量 /体积之比例，而 vol/vol是体 积：体积的比例。2223(五)双向电泳溶液配制水化上样缓冲液（ I）： 尿素(8M)CHAPS(4%)DTT(65mM)加)234.805g0.4g0.098g(现24Bio-Lyte0.2%（w/v ）50mI(40%现加)溴酚蓝0.001% 10mI(1%溴酚蓝)MilliQ水定容到10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存l 上样缓冲液（II）：尿素(7M) 4.2g 硫脲(2M) 1.52g CHAPS(4%) 0.4g DTT(65mM) 0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%（w/v ）50mI(40%现加)溴酚蓝0.001% 10mI(1%溴酚蓝 )MilliQ水装成10小管，-20度冰箱保存 l 上样缓冲液（III）定容到10mI,分尿素(5M) 3g硫脲(2M) 1.52g CHAPS(2%) 0.2gSB 3-10(2%) 0.2g DTT(65mM) 0.098g(现加)Bio-Lyte0.2%（w/v ）2450mI(40%现加)25溴酚蓝0.001% 10mI(1%溴酚蓝 )MilliQ水装成10小管，-20度冰箱保存 l 平衡缓冲液母液定容到10mI,分尿素(6M) 36gSDS(2%) 2gTris-HCI(pH8.8)0.375M 25mI(1.5M) 甘油(20%) 20mIMilliQ水定容到 100mI，分装10管，-20度保存l 胶条平衡缓冲液 I（充分混匀，用时现配）胶条平衡缓冲液母液10mIDTT 0.2gl 胶条平衡缓冲液 II（充分混匀，用时现配）胶条平衡缓冲母液 碘乙酰胺l 低熔点琼脂糖封闭液10mI0.25g低熔点琼脂糖0.5% 0.5gTris（25mM）0.303g甘氨酸(192mM) 1.44gSDS（0.1%） 溴酚蓝（0.001%）1mI（10%SDS） 100mI（1%溴酚2526蓝）MilliQ水热溶解至澄清，室温保存定容到100mI,加（六）同位素实验相关试剂 BERreaction buffer（10ml,分装于-20度）分子 配称取终浓量10ml母液度Hepes-KOH(pH7.8)KCI238. 1M称31 2.3831g74.5 1.4M0.4mI 40mM0.5mI 70m5称1.0437gMDTT 154. 1M称10mI 1mMEDTA2Na251.5425g372. 1M称5mI 0.5m233.7223gM262 2227MgCI 6H O 203. 1.4M50mI 7mM30称2.8462gATPddH O100m 0.2mI 2mMM8.835mIl 2XligaseI activity buffer终浓度母液配10mlHepes(pH7.5) 60mM1M取0.6mlKClMgCI 6H O2 2DTTBSAddH O260mM16mM2mM200 mg/ml1M1M1M0.6ml0.16ml0.02ml2mg至 10mll 2 X Annealing buffer Tris-HCI(pH7.5-8.0) 20mMNaCI100mM2728EDTA2mMl 2X 同位素反应 buffer(polymerase beta 聚合 反应)终浓度母液10mlTris-HCl100mM(pH8.0) 1M1mlMgCI 6H O 20mM2 21M0.2 mlDTTNaCl甘油ddH O24mM40mM20%1M4M0.04 ml0.4 ml2 ml至 10mll 2X APE1 活力鉴定 bufferTrls-HCL终浓度100mM母液1M配 10ml1ml（pH8.0 ）KCl60mM1M0.6mlMgCl26H2O 10mM1M0.1ml甘油ddH O220%2ml至 10mll 同位素电泳上样 buffer(2X)(100ml)终浓度取2829甲酰胺染料 EDTANa290%30mM90ml111.669g X 10-2溴酚蓝（17kd）0.02%0.02g二甲苯蓝0.02%0.02gl 10 X TBE bufferTris 0.89M 26.945g 硼酸（pH8.3） 0.89M 13.757g Na2EDTA 20mM 1.86115g l 15% Denatured DNA PAGE gel(100ml) 10 X TBE 15ml40%,19:1 gel stock 37.5mlddH2O 16mlUrea48g存放在 4 度，使用前加 200 ml 10%AP 和 20ml TEMEDl 20% Denatured DNA PAGE gel10 X TBE 15ml40%,19:1 gel stock 50mlddH2O 3.5mlUrea(尿素) 48g存放于 4 度，使用前取 35ml 混合液加 140ml 10%AP 和 140 ml TEMED2930l 硼氢化钠（1M） 37.83粉末 0.7566gddH O 10ml2l 2 X dRP buffer（分装保存于负 20 度）分子量 母液 终 浓 配 10ml 度Hepes(pH7.5) 238.31 1MMgCl26H O 203.30 1M2100mM 1ml20mM 0.2mllKClDTTddH O274.55 1M40mM 0.4ml154.25 1M4mM 0.04ml8.36mlDNA binding buffer终 浓 母 分 子 配 度液 量 250mlTris-HCI(pH8.0) 50mM 1M12.5NaClMgCl 6H O2 2GlycerolNP-40100mM10mM10%0.1%58.3 1.4625g203.3 0.51g25ml0.25ml3031（七）酶切打质谱相关配方NH HCO (79.06) 100mM4 3粉末 0.7906gddH O 定容到 100ml,pH7.8-8.0 2DTT（154.25g ） 100mM粉末 0.01542gddH O 1ml2IAA(碘乙酰胺，184.96) 200mM312 432粉末 0.036992gddH O 1ml2（八）其他配方l 2XHEPES-缓冲液（潘老师给的配方做细胞转 染，需要调pH为7.05，用0.22mM滤菌，分装 存于-20度）。NaCIKCI分子量58.574.55终浓度280mM10mM称取1.6g0.074gNa HPO 141.961.5mM0.021g葡萄糖HEPESdd H 02180.06238.3112mM50mM0.21g1.19g定容到l CaCI22H2O(2M) 147.02 方做细胞转染80ml潘老师给的配粉末 5.88gddH O 20ml20.22 mm 滤菌，分装存于 -20 度3233l 5XTBS（1L体系）（在利用flag tag带磁珠的 抗体富集蛋白时用）Tris-HCI(250mM) 30.275gNaCI(750mM) 43.875gdd H 02定容至1L（调节pH为7.4）l MMS甲磺酸甲酯（ Sigma 密度为 1.3g/mI,M=110.13）1 M 体系：液体 85mI ddH O 915mI2l Hochest母液：1mg/ml, 避光存于-20 度工作液：母液按 1:1000 稀释l TritonX-100 （0.2% ）TritonX-100 2 mlddH2O1mll 2 X HDM buffe(II) 曾用于 LSD1 去甲基化终浓度母液配 10ml 取Tris(pH8.5) 100mM 1M1mlKCl100mM1M1mlMgCI26H2O 10mM1M0.1ml3334BSA甘油ddH2O1%5%0.1g1ml6.9ml100mmol/L PMSF( 苯甲基磺酰氟 )：分成贮存 于-20 。PMSF 粉末 1.742g异 丙 醇 / 甲 醇定 容 到10ml【注意】PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或 皮肤接触了 PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被 PMSF 污染的衣物应予丢弃。l 5mol/L 氯化钠（NaCl）：氯化钠 29.2gddH 02定容到 100mll 2.5 X gal （5- 溴-4-氯-3-吲哚-半乳 糖苷）：X-gal 25mg二甲基甲酰胺（DMF） 1ml 注意：用铝箔包裹装液管，贮存 -20。 l DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水加 100ul DEPC 于 100ml 水中，使 DEPC 的体 积分数为 0.1。在 37温浴至少 12h，然后 在 15 psi 条件下高压灭菌 20min ，以使残余 的 DEPC 失活。DEPC 会与胺起反应，不可用 DEPC3435处理 Tris 缓冲液。l 1mol/L CaCl2 溶液在 200ml 蒸馏水中溶解 54g CaCl 6H O，用2 20.22m 滤器过滤除菌，分装成 10ml 小份贮 存于-20l 2.5mol/L CaCl2 溶液在 20ml 蒸馏水中溶解 13.5g CaCl 6H O，用 0.222 2m 滤器过滤除菌，分装成 1ml 小份贮存于 -20。l pH 校准液通常称为标液，现在你买仪器一般厂家都会标配 三小瓶粉末：邻苯二甲酸氢钾（pH=4.003），混 合磷酸盐（pH=6.864 ），硼砂（pH=9.182 ）这需 要你把它稀释，一瓶只能兑 250 毫升（250C）的 纯净水，兑好后摇一摇直到充分溶解（三瓶要分 三个瓶子装哦）NaOH(2M) 8g NaOH 粉末定容到 100mLHCL(2M) 10mL 11M HCL 溶液定容到 110 mL35363637（一）WB 相关试剂及常用缓冲液（1-3 页）（2） 细胞和细菌培养基、抗生素（ 4-5 页）（3） 利用 His-tag 从细菌中纯化蛋白配方（ 6-7 页）(四)利用 His-tag 从细胞中富集蛋白配方（8-9 页） (五)双向电泳溶液配制（10 页）（6） 同位素实验相关试剂（ 11-13 页）（7） 酶切打质谱相关配方（ 14 页）（8） 其他配方（14-16 页）37