猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响.doc

猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响虿北蓐业201I,2O(5):3539ActaAgriculturaeBorealioccidentalisSinica猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响司兴奎,顾万军,张济培,陈建红,马春全(佛山科学技术学院动物医学系,广东省高校预防兽医学重点实验室,广东佛山528231)摘要:采用阻断ELISA法对单独接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征组(hpPRRS,B组)及PCV2人工感染21d后接种hpPRRS疫苗组(PB组)不同时期血清中的PRRSV抗体进行检测,同时对不同时期前腔静脉血进行CD4/CD8流式细胞术及血常规分析.结果表明,在接种后32dB组白细胞含量极显着高于PB组(P<0.01),接种后62dB组淋巴细胞含量极显着高于PB组(P<O.o1),接种后75dPB组幼稚型Th细胞含量显着高于B组(P<0.05),接种后32,62及75dB组Tc细胞含量为PB组的2.40,1.98和1.86倍,接种后32,48及62dB组记忆/激活Th细胞含量分别为PB组的1.54,1.46及1.32倍.关键词:猪圆环病毒2型感染;高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗;免疫应答;EIISA;流式细胞术中图分类号:$852.65文献标志码:A文章编号:10041389(2011)05003505EffectsofPorcineCircovirusType2InfectiononImmuneResponsestoPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVaccineSIXingkui,GUWanjun,ZHANGJipei,CHENJianhongandMAChunquan(KeyLabofPreventiveVeterinaryScienceinCollegesandUniversitiesofGuangdongProvince,DepartmentofAnimalMedicine,FoshanScienceandTechnologyUniversity,FoshanGuangdong528231,China)Abstract:Theantibodylevelsrespondedagainsthighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(hpPRRS)weremeasuredbyELISAatdifferenttimeforpigsvaccinatedwithhpPRRSvaccine(groupB,=3),orpigsinoculatedwithbothhpPRRSvaccineat10dayspostinfectionwithPCV2(groupPB,一5),respectively.AndregularperipheralbloodhemanalysisandcytometrywithCD4/CD8monoclonalantibodieswerealsodetected,respectively.TheresultsshowedthattheIeueocytesofgroupBweresignificantlyhigherthanthoseofthegroupPBat32daysafterinoculation(P<0.01),thelymphocytesofgroupBwerestatisticallyhigherthanthoseofthegroupPBat62daysafterinoculation(P<O.01),thenaiveThlymphocytecountsofgroupPBwere2.25一foldincomparisonwiththoseofgroupB,andsignificantdifferencewasobservedatthesametime(P<O.05),theTclymphocytecountsofgroupBwere2.40,1.98or1.86一foldthanthoseofgroupPB32,62or75daysafterinoculation.respectively.andsignificantdifferencewasfoundat32daysafterinoculation(P<0.05);thememory/activatedThcellsofgroupBwere1.54,1.46or1.32一foldthanthoseofgroupPB,respectively;asfarasspecificantibodiesrespondedtohpPRRSvaccinewereconcerned,theS/PratiosofgroupBwerelowerthanthoseofgroupPBduringthistrialexceptforat0or48daysafterinoculation.Keywords:Porcinecircovirustype2(PCV2);Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(hpPRRS);Immuneresponse;ELISA;Cytometry收稿日期:20100622修回日期:20100801基金项目:广东省自然科学基金博士科研启动基金(06300063).第一作者:司兴奎,男,副教授,博士,从事畜禽疫病诊断与防制研究工作.Email:sixingkui163.com西北农业1991年Harding等口首次报道猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS),随后Clark等l_2_3_证实PMWS同猪圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)有关,序列比较结果显示PMWS不同于以往污染PK一15细胞的PCV1,故将与PMWS相关圆环病毒命名为PCV2.PCV2不但是PMWS的致病原,还与猪皮炎肾病综合征(PDNS),仔猪先天性阵颤(CT),母猪繁殖障碍及仔猪腹泻等疫病有关,其中以PMWS危害最为严重.有研究表明,PMWS病猪可表现出胸腺明显萎缩甚至消失,免疫组织器官中并指细胞,滤泡间树突状细胞和淋巴细胞减少或衰竭,CD79aB细胞主要依赖区域的淋巴滤泡界限模糊甚至消失,T细胞依赖的副皮质区细胞衰竭等免疫抑制性指征_5.中国PCV2感染和高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome,hpPRRS)均相当严重.尽管PCV2感染情况较为普遍,但只有部分PCV2阳性猪均发展成为PMWS或PDNS.高致病性猪繁殖与呼吸综合征作为2006年来困扰中国养猪业发展的重要疫病,接种油乳灭活疫苗作为防控措施之一,但其免疫效果不确切.为探讨PCV2感染是否影响机体对hpPRRS疫苗体液免疫应答,本试验通过对单独接种hpPRRS疫苗组及先进行PCV2感染10d后再接种hpPRRS疫苗组后不同时相血清中特异性抗体水平进行比较研究,为阐明PCV2感染对hpPRRS疫苗体液免疫应答的影响提供依据.1材料与方法1.1材料1.1.1病毒PCV2SX株由广东省高校预防兽医学重点实验室分离保存.1.1.2试验动物8头29日龄健康皮特兰杜洛克一长白杂交猪,购自广东省惠州某猪场.1.1.3疫苗及诊断试剂盒高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗(NVDCJXA1株)为乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂公司产品(批号0804028);猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA诊断试剂盒为美国IDEXX生物科技有限公司产品(批号09418一KD967).1.1.4标记抗体和主要试剂淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技公司产品;外周血T细胞双色分析的抗体包括:FITC标记鼠抗猪CD4单抗和RPE标记的鼠抗猪CD8单抗,均为美国SoutherBiotech有限公司产品.1.2方法1.2.1动物试验将8头29日龄健康杂交猪随机分为2组,严格进行隔离饲养,其中第1组为单独接种hpPRRS组(B组,rz一3),第2组为PCV2感染21d接种hpPRRS组(PB组,n一5);PB组每头仔猪在29日龄经鼻和VI接种PCV2SX株4mI(TCID.为10一mI),B及PB组试验猪在40日龄时接种高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗仔猪在3,14日龄注射猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(德国勃林格殷格翰动物保健公司产品)及7,21日龄注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征油乳灭活疫苗(山东齐鲁动物保健品有限公司产品),接种剂量均为2mL/头.各组均于接种疫苗前10d(简记为一10),接种疫苗时(简记为0)及接种后4,18,32,48,62和75d采取EDTA抗凝前腔静脉血液,分别进行血液常规,流式细胞术分析及分离血清进行ELISA抗体检测.1.2.2白细胞和淋巴细胞含量测定采用日本SYSMEX东亚公司生产(KX21)的全自动血液分析仪分别对白细胞,淋巴细胞含量进行检测(以"平均数标准差"表示,下同).1.2.3外周血单核细胞CD4/CD8双色流式细胞术分析参照文献1-6的方法进行,流式细胞仪为美国BD公司生产的FAcsca1.bu流式细胞仪(FACS101),在488nm的氩激光波长下进行检测,对外周血单核细胞通过门技术限定于淋巴细胞,分别对CD4CD8,CD4CD8及CD4CD8细胞亚群的相对含量进行检测.1.2.4数据处理根据血常规分析的淋巴细胞的含量计算出CD4.-cD8,CD4CD8及CD4CD8.细胞亚群的绝对含量.1.2.5ELISA法检测猪PRRS抗体按照试剂盒推荐的程序进行.结果判定标准为:样品与阳性血清的比值(S/P)不小于0.4的判为阳性,S/P值小于0.4的判为阴性.2结果与分析2.1白细胞和淋巴细胞含量测定采用全自动血液分析仪对B及PB组试验猪的白细胞,淋巴细胞含量进行检测,结果(表1)表明,接种后418d,B组白细胞含量略低于PB组,但二者差异不显着;接种后1875d,B组白5期司兴奎等:猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响.37.注:BW和PBW分别表示B组和PB组白细胞,BL和PBI分别表示B组和PB组淋巴细胞.*表示在P%0.01水平上的差异.Note:BW.LeucocytesofgroupB;PBW.LeucocytesofgroupPB;BI.LymphocytesofgroupB;PBLLymphocytesofgroupPB.*meanssignificanceat0.01leve1.细胞含量均高于PB组,接种后32d,B组白细胞含量极显着高于PB组(P<0.01),提示PCV2感染可在一定程度上降低机体白细胞含量,进而使机体的免疫功能受到影响.从表1中2组淋巴细胞含量的变化情况可以看出,在整个试验过程中B组淋巴细胞含量均高于PB组,但在接种后418d,2组问淋巴细胞含量较为接近,此后二者淋巴细胞含量逐步加大,至接种后62d,B组淋巴细胞含量极显着高于PB组(P%0.01),结果显示PCV2感染可降低机体淋巴细胞含量,进而使感染组白细胞含量下降,最终使机体的免疫功能受到抑制.2.2外周血单核细胞CD4/CD8双色流式细胞术分析结果采用CD4/CD8双色流式细胞术可以区分CD4CD8幼稚型Th细胞,CD4CD8Tc细胞及CD4CD8记忆/激活Th细胞亚群.对B及PB组外周血单核细胞中各细胞亚群的含量的检测结果见表2.由表2可看出,在接种后4和7d时,B组CD4CD8幼稚型Th细胞含量低于PB组,接种后75dPB组幼稚型Th细胞含量显着高于B组(P<0.05),是B组幼稚型Th细胞含量的2.25倍;接种后1862d,B组幼稚型Th细胞含量均高于PB组.从表2及图1可见,接种后418d,B组CD4一CD8Tc细胞均低于PB组;接种后3275d,B组Tc细胞含量均高于PB组,其中接种后32,62和75d,B组为相应时间PB组Tc细胞含量的2.4O,1.98和1.86倍,且在接种后32dB组Tc细胞含量极显着高于PB组(P%0.01).由表2和图1还可看出,接种后18和75d,B组CD4CD8记忆/激活Th细胞含量低于PB组;接种后4d及接种后3262d,B组记忆/激活Th细胞含量均高于PB组,但在接种后4d两组间记忆/激活Th细胞含量较接近,接种后32,48和62d,B组记忆/激活Th细胞含量分别为PB组的1.54,1.46及1.32倍.从PB组及B组Tc,记忆/激活Th,幼稚型Th的含量变化的总体趋势推断,PCV2感染后可使负责机体免疫回忆反应的记忆/激活Th细胞数量略有升高;PB组幼稚型Th细胞含量在PCV2感染中期下降以及后期显着增高的情况表明,尽管幼稚型Th细胞未接触过抗原,但作为效应Th细胞的储备细胞其数量的在短期阶段下降(接种后1862d)及后期升高(接种后75d)的情况说明PCV2感染可以在短期阶段降低机体T细胞和B细胞对抗原的识别功能,但这种影响持续时间较短,并可完全恢复;在试验期间,PCV2感染导致参与机体特异性细胞免疫的Tc细胞在病毒感染早期(接种后418d)略有升高,而后迅速下降并一直维持到试验结束,这说明病毒感染后期明显抑制机体特异性细胞免疫功能.2.3猪PR抗体阻断检测对B及PB组试验猪相应PRRS抗体水平进行阻断ELISA检测(图1).结果表明,接种后0d及接种后48d,B组抗体S/P值略高于PB组,其余各阶段B组的S/P值均低于PB组,说明PCV2感染对机体产生PRRS特异性抗体有一定的促进作用.另外,在人工PCV2感染及接种疫苗前PB组的S/P值均符合阳性判定结果,这是因为所购仔猪在3,14日龄注射猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗(德国勃林格殷格翰动物保健公司产品)及7,21日龄注射高致病性猪繁殖与呼吸综合征油乳灭活疫苗(山东齐鲁动物保健品有限公司产品).西北农业表2B组及PB组接种后不同时间的CD4/CD8双色流式细胞术分析各细胞亚群的含量Table2ThesubpopulationsofperipheralbloodofgroupBorPBclassifiedbycytometrywithCD4andCD8duringdifferentdayspostinoculation10L一注:B4和PB4分别表示B组和PB组CD4+CD8一幼稚型Th细胞;B8和PB8分别表示B组和PB组CD4一CD8.卜Tc细胞;B48和PB48分别表示B组和PB组CD4CD8记忆/激活Th细胞."*"和"*"依次为P<0.05及P<O.O1差异显着性.Note:B4.NaiveThcellsCD4+CD8ofgroupB;PB4.NaiveThcellsCD4+CD8ofgroupPB;B8.TccellsCD4一CD8+ofgroupB;PB8.TccellsCD4CD8+ofgroupPB;B48.Thememory/activatedThcellsCD4+CD8+ofgroupB;PB48.Themem0ry/activatedThcellsCD4+CD8+ofgroupPB.*and*showthesignificanceat0.05and0.01level,respectively.接种后时间/dThetimeaftcrinoculation图1B及PB组不同接种时间后ELISA抗体的S/P值动态变化Fig.1ThedynamicsofS/PratiosingroupBorPBwithELISAduringdifferentdayspOstinOculatiOn3讨论尽管对PCV2是否为PMWS唯一致病原尚存在争议,但国外一些学者采用PCV2单独感染息生或SPF猪已成功复制出PMWS,且通过组织病理学和流式细胞术均证实机体出现淋巴细胞减少或衰竭及胸腺萎缩等不同程度的损害,说明PCV2可以引发机体发生免疫抑制或免疫妥协4.本研究采用PCV2单独感染健康猪未能复制出典型的PMWS临床表现,但是通过对接种hpPRRS疫苗组和PCV2感染并接种hpPRRS疫苗组试验猪血清中特异性抗体水平进行比较,结果表明PCV2感染确实可以在一定程度上促进机体对hpPRRS疫苗的体液免疫应答,降低机体淋巴细胞含量,进而使感染组白细胞含量下降,最终使机体的免疫功能受到抑制,且在一定程度上影响机体T细胞和B细胞对抗原的识别功能,并在感染后期抑制机体特异性细胞免疫功能,这也给生产中PRRS防控上出现的不尽如人意的实际情况提供了另外一种可能的解释,应引起猪病防制工作者的高度重视.中国PCV2感染情况也相当普遍,部分省和地区抗体或病毒核酸阳性率高达100,且随其他危害猪群的主要疫病被不断消除和控制,与PCV2相关疫病的危害正逐步凸现.据国外学者报道,某些病毒,疫苗或佐剂的免疫刺激可促进PCV2感染猪发生PMWS,本试验中并未发现接种hpPRRS疫苗可加重PCV2感染的临床表现方面的证据口.鉴于猪繁殖与呼吸综合征病毒有抗体依赖作用,即低滴度的特异性母源抗体或由免疫接种产生的低滴度的特异性抗体,不但起不到免疫保护作用,还会使PRRSV更易进入血液中的单核细胞或肺泡巨噬细胞,增强PRRSV的复制功能,导致长期的持续感染,进而加重病情,故在接近整个试验过程中PB组抗体较B组略高,抗体对机体起正向作用还是反向作用,尚有待进一步研究证实_】.而多数学者认为在抗PRRSV感染免疫中,对细胞免疫可能起重要作用的淋巴细胞亚群如幼稚型Th及Tc细胞含量下降,说明PCV2感染一定程度可促进PRRSV感染,这一推论也被施开创等口的研究结果所证实.5期司兴奎等:猪圆环病毒2型感染对高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫应答的影响.39.23r-4Es3E63F73E829(PMWS):preliminaryepidemiologyandclinicalpresentationJ.ProceedingsofAmericanAssociationofSwinePractiti0ners,1997,28:503.ClarkE.PostweaningmuhisystemicwastingsyndromeJ.ProceedingsofAmericanAssociationofSwinePractitioners,1997,28:499501.HamelAL,LinLL,NayarGPS.NucleotidesequenceofporcinecircovirusassociatedwithpostweaningmultisystemicwastingsyndromeinpigsJ.JVior,1998,72:52625267.SegelesJ,RosellC,DomigoM.Pathologicalfindingsassociatedwithnaturallyacquiredporcinecircovirustype2associateddiseaseJ.VetMicrobiol,2004,98:137149.KraknwkaS,EllisJA,MeehanB,etn.Viralwastingsyndromeofswine:experimentalreproductionofpostweaningmultisystemicwastingsyndromeingnotobioticswinebycoinfectionwithporcinecircovirus2andporcineparvovirusEJ.VetPathol,2000,37:254263.NielsenJ,VincentIE,BotnerA,eta1.Associationoflymphopeniawithporcinecircovirustype2inducedpostweaningmuhisystemicwastingsyndrome(PMWS)J.VetImmunolImmunopathol,2003,92:97111.张见武,庄金山,袁世山.中国部分地区高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学研究J.中国农业科学,2008,4l(6):1822一l831.童光志,周艳君,郝晓芳,等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析J.中国预防兽医,2007,29(5):323327.李金海,马孟根,李春,等.四川部分猪场猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒型血清学调查IJ.黑龙江畜牧兽医,2007,11:8384.Io11121314151617芦银华,许立华,华修国,等.猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测J.中国病毒学,2003,18(2):184186.李贺侠,刘茂军,甘源,等.4株高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的分离与鉴定J.江苏农业,2008,24(4):444450.LadekjarMikkelsenAS,NielsenJ,StadejekT,eta1.Reproductionofpostweaningrnultisystemicwastingsyndrome(PMWS)inimmunostimulatedandnonimmunostimulated3-weekoldpigletsexperimentallyinfectedwithporcinecircovirustype2(PCV2)J.VetMicrobiol,2002,89:97-114.BolinSR,StoffregenWC,NayarGP.eta1.Postweaningmultisystemicwastingsyndromeinducedafterexperimentalinoculationofcesareanderived,colostrumdeprivedpigletswithtype2porcinecircovirusJ.JVetDiagnInvest,2OO1,13(3):185194.KrakowkaS,EllisJA,McNeillyF,eta1.Activationoftheimmunesystemisthepivotaleventintheproductionofwastingdiseaseinpigsinfectedwithporcinecircovirus一2(PCV2)J.VetPathol,2001,38(1):3l_42.YoonKJ,WuLI,ZimmermanJJ,eta1.Antibodydependentenhancement(ADE)ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)infectioninpigsJ.ViralImmunol,1996,9(1):51-63.XiaoZ,BatistalL,DeeS,eta1.ThelevelofvirusspecificTcellandmacrophagerecruitmentinporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectioninpigsisindependentofvirusloadJ.JVirol,2004,78(11):59235933.施开创,杨汉春,郭鑫,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪体内病毒动态及免疫反应的影响J.畜牧兽医,2009,4O(2):228234.eo出wCn曙辛:PCJ献_量文H考参口