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基因工程final,1,第二章 基因工程,基因工程final,2,参考书: 1. 基因工程孙明 高等教育出版社 2. 基因工程原理 吴乃虎 科学出版社 3. 分子克隆实验指南 J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis. 金冬雁等译，科学出版社 4. 英国 Principles of Gene Manipulation 5.基因操作原理 中文版 瞿礼嘉、顾红雅 译 高等教育出版社,基因工程final,3,原理：通过基因重组, 让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。 操作水平：DNA分子水平 结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所需要的品种。,利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，经连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞（转化），以期获得基因表达的过程。,什么是基因工程?,基因工程final,4,基因工程(gene engineering) 常和以下名称混用,遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(recombination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。 作动词时是指基因的分离与重组过程。,基因工程final,5,基因工程（打比方）,基因工程final,6,将供体或在细胞外产生的 核酸（物质）分子,插入到病毒(virus)、质粒(plasmid)或 其它载体系统(vecter system)中,从而形成一种新的可连续繁殖的有机体,再整合到那些本来不含该类物质的宿主(host) 受体中,基因工程final,7,基因工程的诞生与发展,20世纪70年代，Paul Berg及其同事第一个创造重组DNA分子,Paul Berg,基因工程final,8,基因工程的诞生与发展,1973年,美国 Herber Boyer教授和Stanley Cohen教授在人类历史上第一次进行了有目的的基因重组尝试，并据此提出了“基因克隆”的策略。,Herbert W. Boyer, Ph.D.,基因工程final,9,基因工程的诞生与发展,1975，发现分子克隆工具酶,利用限制性内切酶（Restrictionendonuclease）切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能,基因工程final,10,基因工程的诞生与发展,1978年，重组胰岛素,基因工程final,11,1979年，人类生长激素,基因工程的诞生与发展,基因工程final,12,First transgenic animal, the golden carp, is cloned by Chinese scientists in 1981. Canadas first biotechnology company, Allelix, is formed in 1995. Today Biotechnology has made a great impact in agriculture ,medicine ,food and many other products.,基因工程的诞生与发展,基因工程final,13,什么是基因?,编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列。包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。,基因工程final,14,DNAexon1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4,转录,Pro-mRNA,mRNA,剪接,翻译,蛋白质,真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系,基因工程final,15,生物进化的分子基础 基因,用进废退，获得性遗传,达尔文进化论,拉马克进化论,过度繁殖，生存斗争 遗传和变异，适者生存,基因工程final,16,基因工程的优点,打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、人与其他生物之间的遗传信息相互重组和转移。,为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上？ 这种嫁接时如何实现的？,基因工程final,17,基因具有相同的物质基础 基因是可切割的 基因是可转移的 多肽与基因之间有对应关系 遗传密码通用 基因可以复制遗传,基因工程研究的理论依据,腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）鸟嘌呤（G）,基因工程final,18,（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,重组DNA操作一般步骤,基因工程final,19,基因工程操作的工具,限制性核酸内切酶,将目的基因片断从受体细胞内提取， 需要基因的剪刀限制性核酸内切酶。 将目的基因与质粒DNA连接， 需要基因的针线DNA连接酶。 将目的基因运入大肠杆菌， 需要基因的运输工具运载体。,基因工程final,20,基因工程final,21,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 定义 是一类能识别双链DNA中特殊的核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 类型 型限制酶 型限制酶 III型限制酶,不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列,基因工程final,22,限制性内切酶的命名,基因工程final,23,型限制酶的特性,有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 如：Sau3A识别 ： GATC BamH识别 ： GGATCC,有的限制酶识别多种核苷酸序列。 如：Hind识别 4种核苷酸序列： 5-CTPyPuAC-3 （Py嘧啶碱基C或T；Pu 嘌呤碱基A或G ）,基因工程final,24,限制酶：BamH ,结构相同，方向相反的重复序列，正读与反读都相同。 旋转对称或左右互补对称结构。 为便于书写，识别序列可以以5 3走向的单链DNA表示。,型限制酶的特性,II型限制酶的识别序列一般都具有回文结构 (palindrome),基因工程final,25,(a)5P单链延伸的粘性末端,(b)3OH单链延伸的粘性末端,粘性末端（粘端）,各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；,型限制酶的切割类型,基因工程final,26,平头末端（平端）,各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；,型限制酶的切割类型,基因工程final,27,被同一种限制酶切断的几个DNA 是否具有相同的黏性末端？,用同种限制酶切割,基因工程final,28,同尾酶（isocaudamer） 有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,同尾酶和同裂酶,基因工程final,29,同裂酶（isoschizomer） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。,基因工程final,30,同裂酶（isoschizomer） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。,基因工程final,31,单酶切法 双酶切法 部分酶切,DNA分子片段化,天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化。,基因工程final,32,1、具有互补粘性末端片段的连接 2、具平末端DNA片段之间的连接 3、DNA片段末端修饰后进行连接 4、DNA片段加杆后连接,DNA片段连接,基因工程final,33,DNA连接酶,只能催化互补粘性末端之间的连接,DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH 末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。,催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低 。,基因工程final,34,具有互补粘性末端片段的连接,基因工程final,35,具有互补粘性末端和平末端片段的连接,基因工程final,36,DNA片段末端修饰后进行连接,核酸外切酶（exonuclease）：在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶的修饰作用,基因工程final,37,DNA片段末端加杆后连接,外切酶修饰,酶切,基因工程final,38,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体,1、条件：,2、种类,质粒、噬菌体、病毒、不同DNA片段组合载体,运载体-基因克隆载体,基因工程final,39,质粒是能自主复制的双链环状DNA分子,质粒克隆载体,基因工程final,40,大肠杆菌质粒载体,可以克隆10kb以下的片段,基因工程final,41,细菌人工染色体克隆载体,一般在10kb以下，能承载40kb左右的外源片段。,基因工程final,42,其他种类的载体包括：PCR克隆载体、噬菌体克隆载体、细菌克隆载体、病毒克隆载体、穿梭克隆载体、细菌人工染色体、细菌表达载体、真核表达载体、昆虫细胞载体、酵母表达载体、体外表达载体、荧光蛋白载体、双杂交载体、信号转导载体、siRNA表达载体、热休克载体、报告基因载体、亚细胞定位载体、转座子构建载体、噬菌体展示载体,载体种类,基因工程final,43,基因操作的基本步骤,获取目的基因 形成重组DNA分子 将重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选含有目的基因的受体细胞 5.目的基因的表达,基因工程final,44,将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来,取出DNA,用限制酶切断DNA,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,提取目的基因的方法,1、直接分离基因,基因工程final,45,细胞内总DNA的提取分离程序,基因工程final,46,双链DNA加热至90-95变性解旋成为单链DNA，成为互补链聚合反应的模版,降温至37-60 与模版复性结合,升温至70-75 ，DNA聚合酶催化引物按5-3延伸，合成模版DNA链的互补链,N个循环，达到2n的拷贝数,2、利用PCR扩增目的基因,PCR原理,基因工程final,47,2、利用PCR扩增目的基因,1、 必须知道待扩增目的基因DNA片段的核苷酸序列 2、待扩增片段两端长约20bp的序列已知， 3、允许扩增的DNA片段长度一般在1kb以内 4、 扩增未知序列或长达几千bp的大基因，需要特殊类型的PCR策略 5、RT-PCR 、免疫PCR 、巢式PCR 、实时荧光PCR、原位PCR技术等30几种,基因工程final,48,PCR之歌 从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。这时有个家伙叫Kary Mullis博士的，他钻出来说体外合成也OK！ 只消把你的模板混上缓冲液，再加些引物核苷和聚合酶。 变性，退火，和延伸。加热凉凉加热好神奇！ 当你想要检测突变，来啊，做PCR吧！当你想要基因重组，来啊，做PCR吧！当你想要侦破大案，来啊，做PCR吧！当你想知道孩子他爹到底是哪个混蛋，来啊，做PCR吧！,Bio-rad 推出的 Scientists for better PCR,基因工程final,49,3、人工基因合成法,直接合成法：已知某基因的序列的前提下,可以用化学方法合成或用PCR技术扩增获取目的因.(如胰岛素基因) 逆转录法:以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。 根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,DNA合成仪,PCR扩增仪,基因工程final,50,目的基因化学合成全片段酶促法连接示意图,基因工程final,51,目的基因与运载体结合-形成重组DNA,提取质粒并用限制酶切割,用连接酶将目的基因和质粒连接,用限制酶切割目的基因和用相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子,基因工程final,52,基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。如用质粒作运载体,则选大肠杆菌为受体细胞 目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。,将目的基因导入受体细胞,将受体细胞进行扩增,将重组DNA导入受体细胞并扩增,基因工程final,53,将重组DNA导入受体细胞并扩增,将目的基因导入受体细胞,将受体细胞进行扩增,转化：外源裸露DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。 转染：如果外源DNA分子是病毒或者噬菌体DNA或RT-DNA，那么把此过程也称为转染。,化合物诱导转化：感受态细胞 电穿孔转化：高电压脉冲产生瞬间通道 超声波处理转化：击穿细胞膜形成膜通道 脂质体介导转化：磷质双层包裹DNA 磷酸钙转染法：动物细胞捕获DNA-磷酸钙沉淀物,常用转化法,基因工程final,54,筛选含有目的基因的受体细胞,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,受体细胞是否具运载体特有的“标记基因”所控制的性状,检测依据,基因工程final,55,1、根据载体抗性基因和相应的药物筛选转化子,2、根据报告基因筛选转化子,3、根据噬菌斑筛选转化子,基因工程final,56,重组子的鉴定,1、根据重组DNA分子特征鉴定,根据重组DNA分子大小 酶切图谱 PCR扩增片段鉴定 DNA杂交法鉴定：Southern 杂交，斑点印迹杂交， 菌落（噬菌体）原位杂交 应用DNA芯片鉴定 根据DNA核苷酸序列鉴定,DNA = 琼脂糖电泳 = 印迹转移 = 预杂交 = 杂交（变性探针） = 洗膜 = 放射自显影或显色,基因工程final,57,重组子的鉴定,2、根据目的基因转录产物（mRNA）鉴定 Northern 杂交：用DNA探针检测RNA分子,mRNA提取 = 甲醛变性电泳 = 印迹转移 = 预杂交 = 杂交（变性探针） = 洗膜 = 放射自显影或化学发光,基因工程final,58,3、根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）鉴定,重组子的鉴定,基因工程final,59,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,总体技术路线,基因工程final,60,基因工程的应用,基因工程final,61,第一次测验题目： 简述基因工程研究的基本技术路线,