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基因工程,1,第七章 基因工程 (gene engineering),基因工程,2,重组DNA医药产品,基因工程,3,第一节 重组DNA技术的原理,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作过程。 也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元素。,基因工程,4,基因工程的操作过程,目的基因的获取,克隆载体的构建,外源基因与载体的连接 （体外重组）,重组DNA导入受体菌,转化子的筛选和鉴定,克隆基因的表达,基因工程,5,目的基因的克隆：,基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,基因工程,6,第二节 核酸的提取及检测,就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,基因工程,7,1. 基因组DNA的分离与纯化,DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA）， 质粒DNA。 总的原则: 保证一级结构的完整性; 排除其它分子的污染;,基因工程,8,一般步骤:,(1) 破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS（阴离子去垢剂） EDTA，使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶 (2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来 (3) 分离DNA,基因工程,9,2. cDNA的分离与纯化,（1）总RNA 的提取 RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 RNase的来源 外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同 创造无RNase的环境 DEPC(焦碳酸二乙酯)（配成0.1%的DEPC 水） 异硫氰酸胍 Trizol试剂,基因工程,10,逆转录过程中cDNA的合成,基因工程,11,Trizol试剂 Trizol的主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。,基因工程,12,0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 -巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。,基因工程,13,Trizol法提取总RNA的实验原理： Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。 在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,基因工程,14,（2）第一链的合成,基因工程,15,（3）第二链的合成,cDNA第二链的合成方法自身引导法,基因工程,16,自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割 发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5端序列 出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用。,基因工程,17,cDNA第二链的合成方法置换合成法,利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。 从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的作用下合成第二链。,基因工程,18,cDNA第二链的合成方法置换合成法,DNApol dNTPs,RNaesH,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAp 5,5,S1,AAAATTTOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,TTTTTTTTTTTTTTOH 3,AAAAAAAAAAAAAA 5,5,TTTTTTTTTTTTTT 3,3,T4-DNA ligase,该方法使用较多,基因工程,19,3. 质粒DNA的分离与纯化,质粒（plasmid）: 指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位 共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的分离,基因工程,20,质粒DNA的提取碱裂解法的原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,基因工程,21,4. 核酸的检测,包括DNA的质量、大小、纯度检测 紫外分光光度法 dsDNA：1A26050ug/ml; ssDNA: 1A260 37ug/ml ; RNA：1A260 40ug/ml; 寡聚核苷酸：1A260 30ug/ml; A260/A280 1.651.85（DNA）； 1.7 2.0(RNA) 比值低，有蛋白质、酚类等污染（why?） 凝胶电泳法,基因工程,22,凝胶电泳技术,样品的物理性质 分子大小、电荷、空间构型 支持物介质 琼脂糖，100-60000bp, 聚丙烯酰胺，1-500bp 电场强度，5V/cm 缓冲液离子强度 TAE, TBE, TPE,基因工程,23,电泳缓冲液是指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。 缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变。,基因工程,24,电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。 电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。,基因工程,25,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力,凝胶类型及浓度（%） 分离DNA片段的大小(bp) Agarose 0.3 500001000 0.7 200001000 1.4 6000300 PAG 4.0 1000100 10.0 50025 20.0 501,基因工程,26,指示剂 溴酚蓝，二甲苯青 终止酶反应; 便于加样; 监视实验进行; 染色剂 溴化乙锭(EB) 吖叮橙,EB可检测到ng级的DNA， 荧光强度与DNA数量成正比,基因工程,27,操作过程,基因工程,28,基因工程,29,DNA分子大小的检测,NEB，1Kb DNA Ladder：3kb=62.5ng， 1kb=21.0ng,基因工程,30,第三节 核酸的分子杂交,杂交的基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补原则退火形成双链.,E.Southern，1975,基因工程,31,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程 就是一个PCR循环，PCR就 是这种循环的不断重复。,第四节 PCR技术 （The polymerase chain reaction）,基因工程,32,PCR原理：,请注意引物结合的位置,基因工程,33,第五节 基因文库的构建,1. 基因文库的概念 基因文库DNA library, DNA bank： 用重组DNA技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体DNA的所有片段随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的克隆，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。,基因工程,34,基因工程,35,基因组DNA文库，Genomic libraries : 含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体； cDNA文库，cDNA libraries：是指含有所有重组cDNA的克隆群体。,基因文库的种类:,基因工程,36,2. 目的基因的获取,来源于生物材料： cDNA PCR反应： 目的基因的（部分）序列已知 化学合成法： 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列,基因工程,37,3. 用于基因克隆的载体,定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 常用载体： 克隆载体，表达载体 如：质粒载体，噬菌体载体， YAC，动植物病毒等。,基因工程,38,载体的基本特点:,能自主复制； 具有一个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。,基因工程,39,质粒载体,ori 复制起点 MCS 多克隆位点 Ampr 氨苄青霉素抗性基因 LacZ -半乳糖苷酶基因的部分序列 P 启动子,基因工程,40,PGEM-T载体图谱,基因工程,41,4. DNA的体外重组,基因工程,42,EcoR,回文序列 palindromic seq,限制性核酸内切酶,基因工程,43,粘性末端 cohensive end,平末端 blunt end,基因工程,44,常见的限制性内切酶酶切位点,基因工程,45,DNA连接酶（DNA ligase）,DNA连接酶催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。,基因工程,46,限制性内切酶识别的靶序列与DNA的来源无关，任何不同来源的DNA，经过适当限制酶处理后，都能通过它们的粘性或平齐末端连接起来，这是DNA重组技术的基础。,基因工程,47,5. 重组DNA分子的转化,转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。,基因工程,48,6. 阳性克隆的筛选和检测,基因工程,49,阳性克隆的检测方法:,抗药性标记选择 蓝白斑筛选 分子杂交法 插入片段大小的鉴定（酶切，PCR） 测序,基因工程,50,许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）载体上带有大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸（ LacZ ）的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读码框（ORF），可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。,蓝白斑筛选的原理： （-互补）,基因工程,51,乳糖操纵子,LacZ基因编码半乳糖苷酶 分解XgalBlue product LacZ,复习,基因工程,52,这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞(如E. coli DH5 )。 因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。 这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。,基因工程,53,由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。 然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。,基因工程,54,基因工程,55,互补的检测,基因工程,56,基因工程,57,7. 基因文库的应用,建立和使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。 如果一个哺乳动物的基因组是 3109碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的 DNA片段在技术上是很困难的。 但是在基因文库中，不同的 DNA片段都分别在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简单的工作。,基因工程,58,基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。 得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。,第六节 克隆基因的表达,基因工程,59,表达载体,
