基因工程中的酶课件.ppt

1,第三节基因工程中的酶学,了解各种酶在基因工程中的作用 掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性 逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？,2,3,重组DNA技术中常用的工具酶,4,第一 限制性核酸内切酶,这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。,5,一、限制性内切酶概念的提出,寄主控制的限制（restriction）与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。,6,为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的DNA呢？,7,R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶,8,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 以(k)噬菌体侵染E.coliB为例,9,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,10,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）, Dam甲基化酶,GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基, Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,11,12,R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解,13,切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。,14,I 型限制性内切酶,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型,II 类限制性内切酶,III类限制性内切酶,不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。,基因工程的工具酶,切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp27bp，对分子克隆操作亦无实用意义,15,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。,II类限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind ,16,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。,识别位点处。,17,EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端,（3）平末端（ blunt end ）,两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。,18,两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段,（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,19,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,3-,5-,20,CTGCAG, 3端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,5-,3-,21,与DNA结合的限制性内切酶BamH 1的结构。限制性内切酶识别双链DNA序列5-GGATCC-3，并在两个GG残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有5粘性末端的DNA片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。,22,连接便利,（5）粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。,23,24, 补平成平齐末端, 5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,25,同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶 如Sma I和Xma I的识别序列为 5-CCCGGG-3,但酶切位点不同。 Sma I 5-CCCGGG-3, Xma I 5-CCCGGG-3,同位酶,26,同裂酶（Isoschizomers）,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端 Example: 限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶 (CCGG) ，,5 C .CGG 3 3 GGC .C 3,27,同尾酶（Isocaudamer）,这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的 BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T,28,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,第二 DNA 连接酶,一、DNA连接酶（ligase)的发现,DNA复制一定有断口。,基因的“针线”,29,DNA连接酶,在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键,30,（1）大肠杆菌连接酶,1. 两种DNA连接酶,只能连接粘性末端。,二、DNA ligase的特点,（2）T4噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。,31,（1）必须是两条双链DNA或DNA-RNA。,（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+,2. 连接条件,32,3.DNA连接酶的基本性质,33,DNA连接酶的基本性质,34,连接酶反应的最佳温度是37C。,三、连接反应的温度,1. 最佳温度,但在37下粘性末端的结合很不稳定。,2. 实用温度,所以一般采用 416 C。,35,第三 DNA聚合酶,一、基因工程中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶,36,二、DNA聚合酶在基因工程中的用途,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质,一条单链多肽。,53外切酶活性位于N端。,35的核酸外切酶活性 53的DNA聚合酶活性,37,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途,53的DNA聚合酶活性,38,2. Klenow fragment,用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶 I可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。,（1）Klenow fragment的性质,39, 3端补平,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,（2）主要用途,3,3,40, DNA 3末端标记,在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,41,3. 逆转录酶,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：,依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。,来源,RNA肿瘤病毒。,42,逆转录酶的用途,以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。,43,44,第四、碱性磷酸酶,1. 碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来。,Bacterial alkaline phosphatase，BAP,（1）细菌性碱性磷酸酶,（2）小牛肠碱性磷酸酶,Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP,从小牛肠中纯化出来。,具有抗热性。,SDS中加热68oC可完全失活。,45,其用途是： 除去 DNA 片段的 5 - 磷酸，以防止自身环化。,46,第五、T4多核苷酸激酶,1. 来源,从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。,2. 功能,催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。,不论5-OH端突出与否。,47,该酶的用途是： 为化学测序法标记 DNA 的 5 末端；,48,小结,1.限制性内切酶：切割 2.DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 3.DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。,