基因工程酶课件.ppt

1,第二章 基因工程 Gene engineering,2,基因工程的定义,应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品和服务的技术。,3,内 容,基因工程工具酶 基因工程载体 DNA提取与基因制备 重组DNA向宿主细胞内转移技术 重组基因的表达调控,4,基因工程的技术流程,5,工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括：限制酶, 聚合酶, 连接酶, 修饰酶(激酶, 磷酸酶，核酸酶, 甲基化酶)，蛋白酶，溶菌酶 等。,第一节 基因工程工具酶,6,一、限制性内切酶 （Restriction Endonuclease）,1. 细菌的限制一修饰现象被发现 phage 侵入 E.coli 可繁殖 phage 侵入 另一种E.coli 不可繁殖 瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA,7,1968年，Meselson从Ecoli K株中分离出了第一个限制酶EcoK；同年Linn和Arber从 Ecoli B株中分离到限制酶EcoB。 美Hopkings大学 H.Smith从流感嗜血菌中分离 型 限制酶 Hind Arber, Smith获得1978 年Nobel奖,8,2. 限制性核酸内切酶的定义和生物学功能,定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制酶。,生物学功能： A. 防御外来生物在体内繁殖。 B. 限制-修饰系统决定了噬菌体、病毒等具有种属特异性。 C. 阻止了生物远距离种属间杂交优势。,9,Hind III 属名 种名 株名 序数 含义：流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d)的第三种酶,3. 限制酶的命名,第1个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母，大写； 第2-3个字母 是细菌种名的前两个字母，小写； 第4个字母是株名的第一个字母，小写； 用罗马数字表示发现的先后次序。,10,4. 限制酶系统分类,1985年后大量限制酶被发现， 到2005年1月，已经发现 3681种限制酶。 限制性内切酶的分类 型: 特异识别、随机切割 型： 特异识别、同点切割 型： 特异识别、异地切割通常所指的限制酶即类酶,11,限制酶特性比较,I型 II型 III型举例 EcoB BamHI EcoPL 亚基 三种不同的亚基 两个相同的亚基 两种 活性 限制酶、修饰酶 限制酶 限制酶、修饰酶酶反应辅助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM识别位点特性 / 4-6bp回文对称 /识别位点 TGAN8TGCT GGATCC AGACC 切割位点 可变，距离1kb 识别位点中 距3端24-26bp克隆工作中用途 无 有 无 SAM: 硫一腺苷甲硫氨酸,12,5. II型限制酶的识别特点 A. 识别顺序一般为4-7 bp B. 识别切割位点具有旋转对称性(回文结构),4bp HpaC CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG,13,6. 限制酶的切割末端 平端：缺口在识别序列对称轴上（Hind I I ） 5粘端：缺口在对称轴5端一侧（EcoR I） 3粘端：缺口在对称轴3端一侧（Pst I）,限制酶产生的末端的连接 A. 匹配粘端: 直接连接B. 平末端: 万能连接C. 不匹配粘端： S1 Nuclease切去突出端或Klenow补平,14,7. 识别位点与切割方式之间的关系 A.识别不同，切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A- B.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶) eg: BamHI Bg1 - A GATCT -G GATCC - T CTAG A -CCTAG G,15,C.识别相同，切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGGG - -GGG CCC- -G GGCC C-D.识别相同，切割相同同工酶 同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG- -GG CC- -G G CC-甲基化后不可切割 甲基化后仍可切割,16,8.限制酶反应的影响因素1. 温度：一般37C 有例外,如：SmaI 25C， BclI 50C，TaqI 65C2. 缓冲液：高、中、低盐之分 3. 时间：1-2小时4. 反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积5. DNA纯度与构型：,17,A. 纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA， EB，酚，乙醇，硫酸根，DNAB. 构型：切超螺旋需更多的酶 例: lg DNA, EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U Hind 5U Sal I 10U Nar I 20U,18,酶单位的定义： 1U：指在适当的温度和缓冲液条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的酶量。,缓冲液 NaCl 0, 50, 100mmol/L离子强度 Tris-HCl pH7.5-8.0 MgCl2 辅助因子 10mmol/L DTT 抗氧化，保护还原性基团 1mmol/L BSA 使蛋白酶稳定 100ug/mL,19,近末端的切割： eg: AccI GGTCGACC 切不动 CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGACCGG 切不动 eg: EcoRI GGAATTCCCGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切 eg: PmeI GTTTAAAC20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开 GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时， 90%切开,20,星活性(Star Activity)识别专一性下降 eg: EcoRIGAATTC EcoRI* AATT原因：甘油浓度过高，酶浓度太大， 离子强度不适，pH不适(Ph8.0) 存在有害试剂(1%乙 醇, DMSO, 乙二醇) 阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu+代替mg+,21,酶的灭活,65加热15分钟 加入EDTA至终浓度10mM终止反应,琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶 200bp50kb 水平装置 聚丙烯酰胺凝胶 5-500bp 垂直装置,22,. 按下表分别加入各试剂于Eppendorf管中（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）。 DNA g 10buffer 2.5l 无菌水 内切酶 2 总体积： 25l . 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。 . Eppendorf管于37水浴保温2小时,使酶切反应完全。,酶切操作技术,23,. 取l反应液加Loading buffer混匀，于琼脂糖凝胶上电泳。 5. 紫外凝胶成像系统上查看实验结果。,24,限制酶的应用：1. restriction map 2. DNA physical map ：a series of ER3. gene library construction,application,25,26,聚合酶： 细菌DNA聚合酶*E. Coli DNA聚合酶 I（全酶） *Klenow酶 噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶 *测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶 *反转录酶 末端脱氧核苷酸转移酶 RNA聚合酶 SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶,27,连接酶： E. Coli DNA连接 *T4 DNA连接酶 T4噬菌体 RNA连接酶修饰酶： 激酶 T4噬菌体多核苷酸激酶 磷酸酶 *碱性磷酸酶 核酸酶 Ba131核酸酶 S1核酸酶 绿豆核酸酶 RNaseA RNaseT1 DNaseI EXo 噬菌体外切核酸酶 甲基化酶,28,二、DNA聚合酶（DNA polymerase）,依赖于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶(全酶); klenow大片段; 耐热DNA聚合酶 (Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 逆转录酶。 不依赖于DNA的DNA聚合酶: 末端转移酶。,29,1. E. Coli DNA聚合酶 早期基因工程常用 活性: （1）53DNA聚合酶活性 （2）35核酸外切酶活性 （3）53核酸外切酶活性 最适pH7.4，需要scDNA为模板 主要用途：切口平移法标记DNA,活性（3）,活性（1）,30,2. Klenow大片段 枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解 E. Coli DNA聚合酶得到的该酶的大片段 活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性 主要用途： (1)补平3凹端 (2)补平3凹端，末端标记 (3)合成cDNA第二链 (4)体外诱变中从单链模板合成双链 DNA,31,4. T7噬菌体DNA聚合酶 活性： （1） 53聚合酶活性（很强） （2） 3-5 外切活性，为 Klenow的1000 倍 主要用途：修饰后用于测序Sequenase（测序酶）：切除了 99% 以上的 3-5 外切活性。 Sequenase Version 2 ：切除了所有的 3-5 外切活性，是测序 的理想用酶。,3. T4 噬菌体DNA聚合酶 活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性, 比 Klenow强200倍 主要用途: 3突出端切平,32,5. Taq酶等 活性：（1）53聚合酶活性 （2）35外切核酸酶活性 主要用途：耐热，最适温度75 C，专用于PCR 出错率1.110-4 此外，PCR经常用用到各种高保真酶如： Pfu DNA 聚合酶 和Pyrabest聚合酶 等,6.逆转录酶： 源于AWV (鸟成髓细胞白血病病毒)， 或Mo-MLV(Moloney鼠白血病病毒) 活性： (1) 53聚合酶活性 (2) RNaseH活性(即外切RNA酶活性) 主要用途：反转录合成cDNA第一条链,33,7.末端转移酶作用:无模板的情况下，在DNA或RNA3羟基上加dNTP主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(<100nt) (2)DNA的3OH末端同位素标记,34,DNA聚合酶的用途： 1）DNA分子的标记 2）DNA的序列分析 3）DNA的末端修饰 4）合成双链cDNA 5）定点突变 6）基因扩增（PCR技术）,35,三、RNA聚合酶（RNA polymerase） 催化RNA体外合成反应 分类：依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶,36,四、DNA连接酶（DNA Ligase） 定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。 对底物的要求：dsDNA分子，具3-OH末端和5-P末端,用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制 和损伤后的修复中都起关键作用。,37,1. T4 DNA Ligase 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子 反应条件：1）温度 粘端4，平端25 2）pH7.5-8.0 3）阳离子 Mg2+ 4）辅因子 ATP,38,2. E.coli DNA Ligase Mr=74000, NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。,39,3. T4 RNA Ligase 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途:对RNA进行3末端标记。,40,T4多聚核苷酸激酶：催化ATP的 -磷酸基到DNA或RNA的5 OH主要用途:对缺乏 5-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化; 对5OH末端进行同位素标记,五、激酶(Kinase) 对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。,41,六、碱性磷酸酶 去除核酸末端磷酸基团的酶.包括: 细菌碱性磷酸酶(BAP) 牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶(SAP)主要用途: 去除DNA、RNA的5磷酸根，防止片段自身连接;标记（5 端）前除 DNA 或 RNA 5 磷酸,42,43,七、核酸酶（nuclease） 以核酸为底物的水解酶,按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切酶或外切酶 5-核酸酶或3-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、 RNaseA、RNaseT1、DNase、外切核酸酶、 噬菌体外切核酸酶等。 许多核酸酶兼有内切和外切活性,44,2.RNA酶 内切核糖核酸酶,专用降解RNA,1.DNA酶 为DNA内切核酸酶,水解单链或双链 用途:(1)缺口平移标记探针时产生随机切口 (2)降解DNA,45,3. S1核酸酶 作用:降解单链DNA或RNA(酶量小) 降解双链DNA(酶量大) 用途:(1)去除DNA突出端,切为平头 (2)切除cDNA发夹结构,4.外切核酸酶III(ExoIII) 作用:从双链 DNA3OH 逐一降解单核苷酸 不降解单链DNA或3突出的双链DNA 用途:系列缺失亚克隆,46,核酸酶的分类 内切酶 非专一性 外切酶 3-核酸酶 核酸酶 内切酶 5-核酸酶 RNA 外切酶 专一性 非限制性 内切酶 限制性 DNA 外切酶,47,八、甲基化酶（Methylase）1. Dam 甲基化酶 在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基 。 限制酶（Pvu, BamH、Bcl、Bgl、Xho、Mbo、 Sau3A）的识别位点中含 GATC 序列。,2. Dcm 甲基化酶 识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基 。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoR（CCWGG）,48,3. EcoK 甲基化酶 识别位点少，识别 AAC（N）6GTGC 和 GCAC（N）6GTT 序列中 A 的 N6 位置 。,4. Sss 甲基化酶 来自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。 敏感酶：如 Aat、 Cla、 Xho、 Sal 等 。,49,5.甲基化酶的作用 A.修饰酶切位点： Hinc 可识别四个位点（GTCGAC、 GTCAAC、 GTTGAC 和 GTTAAC），甲基化酶 M.Taq 处理 DNA 后，将TCGA 中的 A甲基化 ，所以 GTCGAC 将不受 Hinc 切割。 B.产生新的酶切位点： Dpn 是依赖甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.Taq 处理后形成甲基化（A）产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 Dpn 位点。 C.对基因组作图的影响：在研究哺乳动物 m5CG 、植物 m5CG 和 m5CNG 、肠道细胞 Gm6ATC 的甲基化水平和分布时，可利用限制酶对甲基化的敏感性差异，进行分析,50,九、其它酶1. 蛋白酶 K （Proteinase K） 是具有高活性的丝氨酸蛋白酶，可以水解范围广泛的肽键，尤其适合水解羧基末端至芳香族氨基酸和中性氨基酸之间的肽键。 用途:去除残留的酶类以及样品中的蛋白质,2. 溶菌酶（Lysozymes） 是一类水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶，在分子克隆中常用的是卵清溶菌酶。 用途:破碎细胞,