实验五、碱性磷酸酶米氏常数的测定.doc
实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定目的要求1 学习分光光度法测定的原理和方法2学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 （$）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的绻和$值。、原理、分光光度法的基本原理及方法一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1.原理0 <1005500-图11维生素B】2溶液的吸收光谱曲线2.主要方法：(1) 比较吸收光谱曲线(2) 比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最人吸收波长 为260n m。2$24U 250 2S0 27U 280 2&0 300 波长芳呑濮如哉的些外吸收0<6 V吸 光。.4 度1 苯丙氨酸2酪氨酸3色氨酸(3) 比较吸光度的比值纯DNA"260 8A280 tun）利用吸收光谱对物质进行定量分析1.原理Beer-Lambert （比尔）定律： T=l/| A=lg1/T=lgl0/|A=KCL其为透光率；A为吸光率；|为入射 光强度；I为透射光强度;K諡蠶数；C为溶液浓度；L为溶液光2常用方法(1) 标准曲线法标准曲线与样品的测定条件必须一致。(2) 标准管法测定As、Ax,Cx/Ax=Cs/As，已知Cs， 求得Cx。(3) 摩尔吸光系数法吸光系g蕊錢系評诚L时的（三）米氏常数的测定原理酶促反应TS曲线V 5 m L V =推导岀米氏方程为:K + Sm 1-其中S为底物浓度；为初速度；$为最大反应速度; Km另来氏常数米氏常数心是酶的一个基木特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数心往往可以反 映岀酶与各种底物的亲和力的强弱。测定&和$,可通过作图法求得。最常用的 Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即：1 心 111v V S V以1/IZ对1/S作图，可得一条直线本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP) 水解的/和$反应式：pNPP+HQ> pNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求岀反应速度Vo三、试剂与器材试剂:0.5ptmol/mL pNP、10 mmol/L pNPP、20 mmolL MgCI2> 0.1 mol/L 碳酸钠一碳酸氢钠 pH 10.1 缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 |ng/mL碱性磷酸 酶酶液器材：f旦温水浴锅、722分光光度计四、分光光度计的使用1. 722型分光光度计的外形2仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）:用于设置测 试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T（100.0透射比）或0ABS（零吸光度） “0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3 样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将耍使川的分析波 k位晝上打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉 盖好样品室盖，按“0%T"键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%调100%透射 比 按“方式键” (MODE)将测试方式设置为吸光度方式 (A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 卬，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测 样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作取5支试管编号,0号一支,1 7号各二支，按下表操作：管号0 123456pNP含量(jimol)00.050.10 0.150.200.250.300.5)Limol/niL pNP (mL)0 0.10.20.30.40.50.6H2O (mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入l.OmL20 mmol/L MgCl? (mL)各管加入0.2 mL0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入20mLD 405 nm以对硝基苯酚的绝对量（ymol数）为横坐标，0。4。5诃值为纵址标,绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数值。(二)测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度S (mM)0.50.751.01.5310 mmol/L pNPP (mL )0.10.150.20.30.6蒸徭水(mL )0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液(mL)各加1.0 mL20 mmol/L MgCI2 (mL )各加0.2 mL预热混匀，37C, 5分钟酶液(mL )测定管各加0.2 mL酶液反应时间37C,精确反应10分钟0.1 mol/L NaOH (mL)各加2 mL酶液(mL )空白管各补加0.2 mL酶液OD405三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的0Dfl（OD405nm）o从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量gmol数）, 计算出各种底物浓度下的初速度 （单位以 pimol-U-min-1表示），取倒数1/iz填入表内。以 1/1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Kg和最大反应速度六、注意事项1. 取液量一定要准确。2. 反应时间一定要精确。3. 加酶前后一定要将试剂混匀。4. 空白对照一定要先加NaOH,后加酶。5. 测定OD405时要以各自的空白调零点。6. 移液管或取液器的使用7. 比色杯的使用返也加酶时间(min)0.511.52加NaOH时间10.51111.52反应时间(min)10101010管号2 2f3344552.533.544.5512.51313.51414.515101010101010返叵七、思考题(1) 试说明米氏常数Kg的物理意义和生物学 意义。(2) 为什么说米氏常数&是酶的一个特征常 数而卩11则不是？
