茚三酮比色法测定游离氨基氮.doc

游离氨基酸的测定茚三酮比色法标准曲线绘制1. 实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量。因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。2. 仪器与用具100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；刻度吸管：0.1ml1、1ml2、2ml2、5mll；沸水浴；具塞刻度试管20 ml10；分光光度计3. 试剂3.1.1 水合茚三酮 称取0.6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4.54的醋酸盐缓冲液混匀，棕色瓶中冰箱内保存，10天内有效。3.1.2 氨基酸标准液 称取80烘干的亮氨酸23.4mg，以10%的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ ml），取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。3.1.3 0.1%抗坏血酸 称取0.1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配4. 实验方法取6支20ml试管，按下表加剂： 试剂管号123456亮氨酸标准液(ml)00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮(ml)3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸(ml)0.10.10.10.10.10.1氨基氮量（ug/管 ） 01.02.03.04.05.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min，取出后立即用冷水摇动冷却，用60%乙醇定容至20 ml，摇匀。=570nm处测定吸光度00.0250.0550.0990.1460.1865. 标准曲线绘制以吸光度为纵坐标，氨基氨ug数为横坐标，绘标准曲线如图1。图16. 待测样测定取20ml试管，取待测液1ml，加蒸馏水l ml，水合茚三酮3.0 ml，坏血酸0.1ml，混匀，封口。沸水浴加热1 5分钟，冷水中摇动冷却，用 60%乙醇定溶至20ml，摇匀，于570mn测定吸光度A。7.计算结果：测得吸光度，由标准曲线得知样液的氨基氮ug/ ml m，代入公式十算：A=0.0382m-0.0103A为吸光度，代入公式算得m（ug/ ml）。