华东理工大学本科生微生物学基础实验讲义.doc

第一部分 基础实验实验一 显微镜的使用和微生物的形态观察一、实验目的1. 熟悉显微镜的使用，尤其是油镜的使用2. 熟悉几种常用微生物的个体形态3. 熟悉典型微生物的菌落形态并加以区分二、实验原理1. 显微镜的使用单个微生物是肉眼观察不到的，即使用高倍镜大多数细菌仍观察不清，故需用油镜观察。在用油镜观察时，必须将油镜头浸入香柏油中。香柏油的折光率为1.51-1.52，与玻璃片的折光率1.52相近，因此在物镜（玻璃）与标本片（玻璃）之间加入香柏油可避免光线从一个介质（玻璃）进入到另一折光率不同的介质（空气）而引起的散射。 2. 微生物的形态 微生物种类繁多，根据它们的主要形态分为细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群。微生物个体微小，要识别它们，一是借助于显微镜观察其个体形态，二是直接用肉眼观察其菌落形态(群体形态)。细菌的个体形态一般有球状、杆状和螺旋状三种，放线菌是丝状菌，菌丝分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝，孢子丝形态有螺旋状和分枝状两种，霉菌也是丝状菌，但个体较大，有的有假根、足细胞、青霉穗等，酵母菌则一般呈椭圆形，有些在特殊条件下能形成假丝。菌落是由某一微生物的单个细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后形成的肉眼可见的集落。菌落形态在一定程度上是个体细胞形态结构在群体上的反映。每一类微生物都有其各自的细胞形态，因而其菌落形态也各异。观察微生物菌落，首先要区别细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群的菌落。细菌的菌落多生于培养基的表面，较小、光滑或粗糙、干燥或湿润，多具臭味，易被挑起。霉菌菌丝分枝很多，相互交错形成菌丝体，其表面形成孢子层，菌落大多数呈绒毛状或棉絮状，不易被挑起，多具霉味。放线菌菌丝形状与霉菌相似，因存在基内菌丝，故和霉菌一样与培养基结合牢固，不易被挑起，菌落较小，表面呈紧密的线状或粉状。不少放线菌具特殊的土腥味。酵母菌的菌落类似于细菌，因无菌丝组织而易被挑起，但菌落一般比细菌大、厚且透明度较差，乳白色，有酒香味。三、普通光学显徽镜的构造1.光学显微镜的结构 由一组光学放大系统、调节系统及机械支持组成(图1-1)。机械系统部件 显微镜的机械部件，是安装光学放大系统的基座。它包括镜座、载物台、物镜转换器、镜筒和调节器等。镜座 镜座是显微镜的基本支架，由底座和镜臂两部分组成。载物台即镜台其上放置被观察标本。用低倍镜观察样品(如平皿上的菌落)，用手移动样品就行了，如用高倍镜或油镜观察时，则用载物台上的压片夹（或十字推进器）固定。 粗、细调节旋钮 粗、细调节旋钮是用来调节镜筒或载物台使其上下移动，以达到调焦、使标本观察清晰目的的装置。物镜转换器 其上可配46个物镜。因观察样品时，需从低倍镜转至高倍镜再转至油镜。因此，在物镜转换器上安装有一套不同放大倍数的物镜，以便选择使用。镜筒 物镜的放大率是对一定的镜简长度而言的。镜筒长度的变化，放大率将随之变化，成像质量也有影响。因此，显微镜筒长国际上有标准，定为160mm。光学放大系统部件 光学显微镜的光学系统包括反光镜、聚光器、物镜和目镜等反光镜 是取光设备，它有二个面，一是平面镜，另一面是凹面镜，反光镜安装在弧弓上，可自由翻转调整位置，使光线射向聚光器。聚光器 安装在载物台下，其作用是将经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高度可以调节，以达到最佳亮度。聚光器上还装有孔径光阑，可通过调节光阑，与聚光器配合使光线达到最佳。 物镜 安装在物镜转换器上的透镜。利用光线使被观察物体第一次造像，因而直接关系和影响着成像的质量。低倍物镜 10高倍物镜 40油浸物镜 100目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并使物像映入观察者的眼中。目镜 5；10；15四、实验材料1. 普通光学显微镜，擦镜纸，香柏油，二甲苯，接种环，接种针2. 各类微生物标本(1)球菌：四联球菌(Micrococcus tetragenus) 藤黄八叠球菌(Sarcina lutea) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(2)杆菌：大肠杆菌(Escherillus coli) 枯草杆菌(Bacillus subtilis)(3)真菌：酵母菌（Saccharomyces cerevisae）3. 微生物菌落平板(1)细菌：四联球菌、大肠杆菌和枯草杆菌混合液(2)放线菌：链霉菌5406(S. jingyangensis)链霉菌属各类代表种平皿培养物(3)霉菌：毛霉(Mucor)、青霉(Peniciellium)、曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)(4)酵母菌：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisae)(5)噬菌体：林肯链霉菌噬菌斑五、实验步骤（一） 显微镜的使用1.显微镜从显微镜柜或木盒内拿出时，用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬到实验桌上。2.调节光源 可利用灯光或自然光，并通过反光镜，聚光器和光阑调节光线，使视野的光线最佳。 3.将标本片置于载物台上并用标本夹夹住，注意正面向上。4.低倍镜观察 由于低倍镜视野较大，易发现目标，故观察标本需先用低倍镜观察。 将低倍镜旋至镜筒下，调节粗调节器，使物镜降至距标本片5mm左右，由目镜观察慢慢向上旋转粗调节器，直至发现视野中的物象，然后再用细调节器调至物象清晰为止。将物象移到视野中央，转至高倍镜观察。 5.高倍镜观察 将低倍镜转换为高倍物镜。在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调整光亮适度，缓慢调节细调节旋钮，至物像清晰为止，并移至视野中心准备用油镜观察。6.油镜观察 将高倍镜转换为油镜。在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油，从侧面观察，镜筒缓慢地下降，使油浸物镜浸入香柏油中。从目镜内观察，通过调节光阑，聚光器，使光线达到最强。用粗调节旋钮将镜筒慢慢上升(此时绝不能将镜筒下降)，当出现物像后再用细调节调至最清晰为止。7.观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜偏位，并用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，擦去镜头上残留油迹。将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜成八字形，再下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜对号放于显微镜箱中。（二）微生物形态观察1. 用显微镜油镜观察球菌和杆菌的个体形态标本片。2. 观察细菌、放线菌、霉菌和酵母菌在固体培养基上形成的菌落形态以及噬菌体所形成的负菌落（噬菌斑）。注意菌的大小、颜色、气味，表面有无光泽，是否光滑透明、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况，菌落边缘是否整齐。观察酵母菌与细菌菌落有无区别，用接种环挑一下菌落是否容易挑起。观察丝状微生物的菌落是疏松的棉絮状或绒毛状，还是比较紧密的粉状，菌落表面与背面颜色是否相同，有无水溶性或脂溶性色素，菌落是否易被挑起。对于噬菌体应注意空斑大小及形态。3. 示教观察(1) 细菌的个体形态：逗号弧菌(Vibrio comma)(2) 杀螟杆菌(Bacillus thuringiensis)不同阶段的个体形态：营养体、孢子囊、芽胞。(3) 细菌的特殊结构：杀螟杆菌的芽胞，自身固氮菌(Azotobacter)的荚膜，变形杆菌(Proteus vulgaris)的鞭毛。(4) 放线菌的形态观察：孢子丝和孢子形态观察，沉浸培养下菌丝形态的观察(5) 酵母菌个体形态的观察：啤酒酵母(6) 霉菌个体形态的观察：青霉、曲霉、根霉、毛霉菌丝，分生孢子、子囊孢子六、 注意事项1. 香柏油不能过多，只需一小滴。2. 香柏油从瓶中取出时，切勿搅动，滴上玻璃片时也不要涂抹，以免形成气泡。3. 使用油镜时尽量将聚光器向上，光阑放大。4. 用油镜时假如一再看不清物象，可验看油中是否存在气泡，可将镜头及标本片上的油擦去，重新滴加，以消除气泡。七、 实验记录1. 绘图表示各类微生物的个体形态。2. 列表说明各类微生物菌落特征。八、 思考题1. 油镜使用时为何一定要浸在香柏油中？2. 在使用油镜时应怎样控制聚光器和光阑？3. 如何区别微生物四大类群的个体形态及菌落特征？实验二 培养基的制备和灭菌一、 实验目的 1. 了解培养基的配制过程 2. 熟悉培养基灭菌过程，并了解其它灭菌过程二、 实验原理 培养基是人工提供的微生物在实验室的生活环境和场所。自然界中，微生物种类繁多, 营养类型不同，对营养的要求也各不相同。但均应含有满足微生物生长发育所需的水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子以及某些特需的微量元素等。此外培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及适宜的渗透压。 培养基主要用于分离、培养、保存和鉴定微生物。培养基的种类很多，有专门培养放线菌的高氏培养基，用于培养霉菌的蔡氏（Czapek）培养基，用于培养细菌的蛋白胨牛肉浸液（L.B.）培养基等。根据培养基的物理状态的不同，又分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基琼脂加量为1.5-2.5%，半固体培养基琼脂加量为0.4-1.0%，液体培养基则不需要加琼脂。三、 实验材料1.培养基成份：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂等。2.试剂：1N NaOH溶液，1N HCl溶液3.仪器及玻璃器皿：pH试纸（6.4-8.0）, 三角烧瓶，试管，烧杯，搅棒，量筒，纱布，漏斗，台秤，吸管，药匙，棉塞，铜丝筐，棉线，牛皮纸，高压蒸汽灭菌锅。四、实验步骤培养基配制的一般步骤为： 原料的称量溶解调节pH过滤澄清分装塞棉塞和包扎灭菌。 1原料称量：根据培养基配方，由计料体积计算出各种原料的所需用量，然后准确称取各种原料成分。 2. 溶解：一般情况下，几种药品可一起倒入烧杯内，先加少于计料体积的水进行加热溶解，但如有磷酸盐和钙盐等混合在一起时易产生磷酸钙和磷酸镁沉淀，所以要分别溶解。加热溶解时要不断搅拌，待药品完全溶解后，补足水分至计料体积。配制固体培养基时，预先将琼脂称好用剪刀剪成小段，以便溶化，然后将液体培养基煮沸，把琼脂放人，继续加热至琼脂完全融化。注意在加热过程中应注意不断搅拌，以防琼脂沉淀糊底烧焦，待琼脂完全融化后，再用热水补足因蒸发而损失的水分。3.调节pH值：液体培养基配好后，一般要调节至所需的pH值。在调pH前先用pH试纸测一下培养基的原始pH。常用盐酸和氢氧化钠溶液进行调节，用精密pH试纸进行测定。固体培养基酸碱度的调整，与液体培养基同，一般在加入琼脂前进行。 4.过滤和澄清：如有特殊要求用滤纸或四层纱布过滤。 5.分装：培养基配好之后，要根据不同的使用目的，分装到各种不同的容器中。（图4-1） a.试管斜面分装 在15150mm试管中加入约3ml培养基，加上棉花塞后灭菌，然后在未凝固前将试管搁在玻棒或木条上即可。搁置的斜面要适当，一般不超过试管长度的二分之一。（图4-2） b.半固体培养基的分装 在15150mm试管中加入约3ml培养基，加上棉花塞后灭菌，竖直凝固后即可。 c.液体培养基的分装 在15150mm试管中加入约3ml培养基或在250ml三角烧瓶中加入约25ml培养基，加上棉花塞后灭菌即可。d. 固体培养基三角烧瓶的分装（一般用于倒平皿） 琼脂可按每个三角烧瓶中加培养基量计算，称量后直接加入三角烧瓶中（不需熔化），然后加入溶解好后的培养基，一般250ml三角烧瓶中加入100ml培养基，加上棉花塞后灭菌即可。 6.灭菌 灭菌前，棉塞上面要包上牛皮纸，以防灭菌时冷凝水弄湿棉塞。试管可几个包在一起或放在铜丝筐内，上盖牛皮纸，三角烧瓶则需分别包扎。 培养基配好后，应立即灭菌，如无法及时灭菌应放入冰箱。五、思考题1. 用高压蒸汽灭菌，如何达到较好的灭菌效果？2. 在同样的条件下，为什么湿热灭菌的效果好于干热灭菌？3. 高压蒸汽灭菌后，为什么排气不能太猛？为什么须待降到零磅才能打开锅盖取出物件？4. 为什么配好培养基须即刻灭菌？附1：灭菌法灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。在微生物实验、生产和科研工作中，需要进行纯培养，即不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌。 常用的灭菌方法有干热灭菌、加压蒸汽湿热灭菌、射线灭菌等。一、干热灭菌(一)火焰灼烧：适用于微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，可直接火焰上烧至红热进行灭菌。这种方法灭菌迅速彻底。此外，接种过程中，试管或三角瓶口，也可通过火焰灼烧进行灭菌。 (二)热空气灭菌：适用于玻璃器皿的灭菌。将电烘箱温度调至160-170，灭菌2小时。它是利用干燥热空气杀死微生物的方法。二、热灭菌（高压蒸汽灭菌）（图4-3）高压蒸汽灭菌是微生物灭菌技术中应用最广、效果最好的湿热灭菌方法。 将待灭菌物件放在高压蒸汽灭菌锅内，在0.1MPa(1kg/cm2)压力下，温度达到121灭菌20-30分钟。适用于培养基、工作服等的灭菌。 （一）灭菌原理 高压蒸汽灭菌是在一个密闭的高压蒸汽灭菌器(锅)中进行的。其原理是水的沸点随压力的增加而升高。当水在高压蒸汽灭菌器(锅)中煮沸，产生蒸汽驱逐出锅内的空气后，随着蒸汽不断产生，锅中的蒸汽压力也随之提高。蒸汽压力提高，水的沸点随着上升，因而能够获得比100更高的蒸汽温度，用来进行有效的灭菌。特别要注意的是，在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气必须完全排除。因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，当水蒸气中含有空气时，灭菌锅的压力表所表示的压力是水蒸汽压力和部分空气压力的总和，而非水的饱和蒸气压，它所对应的温度与灭菌锅内的温度是不一致的，没有达到121，灭菌就不彻底。（二） 灭菌步骤 1.放妥待灭菌物件，加盖，旋紧螺丝，使灭菌锅密闭。1. 加水到要求的加水刻度范围。2. 点火加热，打开排气阀，待排出锅内冷空气后，关闭排气阀。3. 当蒸汽压力上升到0.1MPa(1kg/cm2)时，稍微打开排气阀使少量蒸汽排出，同时关小加热源，使锅内蒸汽压力维持在0.1MPa(1kg/cm2)。4. 维持20-30分钟后，切断加热源，稍微开大排气阀，缓慢排气，待压力降至零位时，方可打开锅盖，稍微冷却后即可取出灭菌物件备用。 四、 射线灭菌一般用紫外线。紫外线具有杀菌作用，常用于无菌室的灭菌。附2：棉花塞的制作（图4-4）棉花塞用于防止杂菌污染同时保证良好的通气。所以棉塞要做得适宜，过紧影响通气，过松起不到滤菌的作用。一般棉塞的形状象未开伞的蘑菇，棉塞长度的三分之一在试管口外，三分之二在试管口内。有时为保证通气，三角烧瓶的棉塞可用八层纱布代替。（图4-5）附3：吸管的包法（图4-6） 在吸管口塞上脱脂棉（约1.5cm左右），以防菌液吸入口中并起过滤作用，以免口中的菌吸入管中。塞棉花时要注意松紧，以吹时既能通气又不使棉花滑下为宜。然后将尖端放在4-5cm宽的长纸条一端（报纸即可），约成30角折叠纸条包住尖端，用左手握住吸管管身，右手压紧吸管，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结即可。实验三 微生物的接种分离、纯培养和计数一、 实验目的1. 学习微生物的接种和纯种分离操作2. 学习微生物的平板活菌计数和血球计数二、 实验原理自然界中的微生物都是杂居在一起的，通过分离，使它们由混杂状态到单个个体从而在固体培养基上成为一个菌落，就可获得纯种。纯种分离的方法很多，其原理是将待分离的样品进行一定的稀释，并使之分散，在固体培养基上形成单个菌落，再转接到适当的培养基上，一般就认为是纯种。微生物接种技术是将微生物接到适于生长繁殖的人工培养基或生物体内的过程，是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，接种方法也不同，如斜面接种、液体接种、半固体穿刺接种等。接种方法的不同，采用的接种工具也不同，如接种环、接种针、移液管和刮铲等。血球计数法原理：血球计数器(Blood Cell Counter)为一特别的载玻片，上面刻有很多线条，相互分离成一定面积的方格，当加上盖玻片后，由于载玻片于盖玻片之间存在一定距离使形成一定容积的小室。当滴入待测样品。则菌液均匀充满小室，在显微镜下计算小室内的菌数，即可换算成单位体积样品中所含的菌数。平板活菌计数法原理：微生物在固体培养基上形成的单菌落，一般认为是由一个细胞繁殖而来，即一个菌落代表一个细胞。根据这一原理，计数时，将待测样品作一系列稀释，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，并使其均匀分布。经培养后，生长形成单菌落，由菌落数即可推算出单位体积菌液的活菌数。为获得生长良好的纯种微生物，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。无菌操作有问题,实验结果就不可靠。在发酵工业中如无菌操作不严格会造成染菌，给生产带来危害，影响经济效益，所以我们应牢固树立“无菌操作”的概念。三、 实验材料1. 菌种：四联球菌，大肠杆菌，枯草杆菌，变形杆菌，细菌混合菌液，啤酒酵母的菌液2. 培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基，牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨半固体培养基，沙保琼脂培养基，无菌生理盐水3. 其他：接种针，接种环，无菌培养皿，无菌吸管，记号笔，血球计数器，显微镜四、 实验步骤（一） 接种法1. 斜面接种技术 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。(1)接种前在待接种斜面试管上用记号笔注明菌名、接种日期、接种人姓名等。 (2)接种 用接种环将菌种移接到做好标记的试管斜面上。无菌操作过程简述如下：(a)将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两支试管的中间（斜面向上）。用右手将棉塞旋松，以便接种时拔出。(b)右手拿接种环，使其垂直于火焰中，先烧红环端，然后将有可能伸入试管的其余部分也过火灭菌。(c)用右手的无名指、小指和手掌边夹住两试管的棉塞，轻轻拔出，将试管口过火后移开，但使试管口仍靠近并面向火焰。(d)将接种环伸入菌种试管内，在试管壁将接种环冷却后沾取少量菌体。(e)将接种环引入待接种的斜面,自下而上在斜面上划一直线或曲线即可。(f)取出接种环，将试管口再次过火后塞上棉塞，灼烧用过的接种环并放回原处。(g)将棉塞塞紧，放入37恒温培养箱内培养24小时。2.液体接种技术(1)同上法以无菌操作挑取少许菌体引入待接种的液体培养基中，在接近液面处的试管壁上轻轻摩擦，并适当摇动，使之均匀分布在液体中。(2) 塞紧棉塞后，放入37恒温培养箱内培养24小时。3.穿刺接种技术 是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并穿刺到半固体的培养基中的接种方法。 (1)同上法用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺于半固体培养基中间，刺至管底，再按原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速。(2)塞紧棉塞后，放入37恒温培养箱内培养24小时观察结果。如生长只限于接种直线，说明细菌不运动，如生长不限于接种直线而四周蔓延，则说明细菌能运动。（二） 分离法 1.琼脂平板划线分离法（1） 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热熔化后，冷却至45左右。（2） 左手持盛有上述培养基的三角瓶，在火焰附近，用右手手掌边夹取棉塞，将三角瓶转移到右手，并使瓶口过火。（3） 左手取一无菌培养皿，在火焰边稍稍打开皿盖，倒入熔化的上述培养基15ml左右，放在桌面上轻轻摇匀，待凝后即成平板。（4） 以无菌操作用接种环沾取待分离的混合菌液。（5） 左手持培养皿底并使其面向火焰，依次轻轻而迅速地一条条紧接着划线，划线距离要恰当（尽量靠近，以充分利用表面积，但线与线之间不能碰到），划过下面后切勿再回上去重复划。（6） 盖上培养皿盖，倒置于37恒温培养箱中培养24-48小时后观察结果。2.稀释分离法（1）取无菌生理盐水（含NaCl0.85%）试管三支（每支装量4.5ml），用记号笔编号I，II，III。（2）以无菌操作取混合菌液一接种环于I号试管中，摇匀。（3）同法自I管至II管，自II管至III管。（4）用1ml无菌吸管，分别从III，II，I管中吸取0.2ml于三个无菌培养皿中，并相应地注明编号。（5）倒入熔化后冷却至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml左右，轻轻摇匀，待凝后倒置于37恒温培养箱中培养24-48小时后观察结果。 （三）微生物计数 血球计数法：1. 血球计数器的构造血球计数器是一块特制的厚载玻片，由4条平行的槽构成3个平台。较宽的中间平台被单一短槽分隔成两半，每半平台上均刻有长宽各为1mm的大方格，中间平台下陷0.1mm，所以当盖上盖玻片后，计数室的体积为0.1mm3即110-4ml.血球计数器常有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格再分成16个小方格。两种规格的计数室一个大方格均为400个小方格。2.血球计数(1)取待测啤酒酵母菌液，摇匀作适当稀释，菌液稀时可不必稀释（以每个中格内约10-20个菌体为宜）。(2)取洁净干燥的血球计数器一块，盖上盖玻片，用滴管吸取少许菌液沿盖玻片边缘滴一小滴（不易过多），则菌液自行渗入计数室内，静止片刻。(3)在低倍镜下找到计数室，要注意光线不能太亮，再转到高倍镜下，取标号的5个中方格进行计数（计数时应时刻调节焦距，使不同焦距的菌体都计入，在线上的菌，数上不数下，数左不数右）。(4)菌液浓度计算菌液浓度（菌数/ml）N2.5105稀释倍数N为中格内菌数的平均值。平板活菌计数法1. 取六套无菌培养皿，分别用记号笔标明10-4，10-5，10-6各两套，另取六支盛有4.5ml生理盐水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。2. 将酵母菌液混匀，用1ml无菌吸管吸取0.5ml放入10-1生理盐水中，摇匀。依次稀释至10-6。3. 从10-4，10-5，10-6管中分别吸取0.5ml于的10-4，10-5，10-6无菌培养皿中。4. 于上述放有各稀释度菌液的培养皿中，倒入熔化并冷却至45左右的沙保琼脂培养基约15ml，立即轻旋混匀，待凝后倒置于28恒温培养箱中培养48小时后计数（选择菌落数在20200个左右的培养皿进行计数）。 5. 菌液浓度（菌数/ml）菌落数稀释倍数2五、 实验记录1. 记录接种及分离实验的结果。2. 血球计数法得出的菌液浓度（个/ml）3. 平板活菌计数法得出的菌液浓度（个/ml）六、 思考题1. 微生物的纯种分离通常采用哪些方法，并说明各自的优缺点。2. 什么叫微生物的污染？如何防止？3. 用血球计数法和平板活菌计数法得出的菌液浓度是否一致？为什么？4. 平板活菌计数法中，为何选择生长有20200个菌落的平板计数？实验四 微生物的染色一、实验目的1. 学习微生物的染色技术2. 熟悉普通染色法、革兰氏染色法和芽孢染色法3. 了解负染色法和鞭毛染色法二、实验原理 微生物的染色是微生物学实验中的一项基本技术。微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。染色后微生物细胞与背景形成明显的色差，从而能清楚地观察到其形态。 用于微生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，可与带负电荷的物质结合。而微生物蛋白质常带负电荷所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。中性染料是前两者的结合物又称复合染料。 普通染色法是利用一种染料使微生物着色。它操作简单，但仅能显示其基本形态。 革兰氏染色法是细菌学中的鉴别性染色法。通过革兰氏染色可将细菌区分为革兰氏阳性菌（反应呈初染剂的颜色）和革兰氏阴性菌（反应呈复染剂的颜色）两大类。 此染色法能将细菌分为G菌和G菌，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分的不同。G菌细胞壁中肽聚糖层厚、交联度高，且脂类含量低，经乙醇脱色后反而使肽聚糖层的孔径缩小，细胞壁通透性降低，因而仍保留初染剂的颜色。G菌的细胞壁中肽聚糖层较薄、交联度低，脂含量高，用乙醇脱色时脂类物质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌被脱色，复染后染上了复染剂的颜色。 芽胞染色法 利用芽胞和营养体对染料的亲和力不同而使芽胞和营养体染上不同的颜色，从而更明显地衬托出芽胞，便于观察。细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状)。芽胞染色法就是利用芽胞既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点，除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色，再使菌体脱色，而芽胞上的染料则难以渗出，仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色。 荚膜染色法 荚膜是包围在细菌细胞壁外面的粘液性物质，主要成份为多糖。由于其与染料亲和力弱，不易被着色，一般采用负染色法，即将菌体着色，又将背景着另一颜色，而使不易着色的荚膜形成一透明区，以便观察。 鞭毛染色法 鞭毛是细菌的运动器官，细菌的鞭毛极细（直径一般为10-20nm），用普通显微镜看不到，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，使媒染剂与染料堆积在鞭毛上，加宽鞭毛的直径，则在普通光学显微镜下也能观察到。三、实验材料1.菌种：大肠杆菌和四联球菌混合液，杀螟杆菌，自身固氮菌，变形杆菌2.染色液：石炭酸复红液，结晶紫液，路哥尔(Lugal)碘液，芽胞染色液，荚膜染色液，鞭毛染色液（以上染色液配制法见附录）3.仪器及器皿：显微镜，载玻片，接种环，二甲苯，香柏油，擦镜纸，吸水纸，煤气灯或酒精灯。四、实验步骤（一）普通染色法（图3-1）1. 涂片 将接种环在火焰上烧红，稍冷后以无菌操作自试管中取少量菌液于洁净无油腻的玻片中央，涂成薄层。如为固体培养基上的菌种，则先在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水，用无菌操作法挑取少许菌体与水滴充分混匀，涂成薄层。2. 干燥 室温中自然干燥，也可在火焰高处烘干，但不能过烫，以手背试温不烫手为宜。3. 固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，于火焰中通过3次(用手指触涂片反面，以不烫手为宜)，不能在火中烤，以免菌体形态受到破坏。待玻片冷却后，再加染料。4.染色 将玻片放平，在其上加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红染色液)，染色约一分钟。5. 水洗 染色时间到后，用水冲去染料直至流下的水无色为止。冲洗时注意水流不能太急，且不能冲洗有菌的一面，以防将菌体细胞冲跑。 6. 干燥 自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。 7. 镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。 注意：1.玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 2.挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚不易观察。（二）革兰氏染色法1涂片，干燥，固定见普通染色法。2.染色 初染 加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色约一分钟后用自来水小心地冲洗。 媒染 加路哥尔碘液，约一分钟后水洗。脱色 用95乙醇脱色20秒水洗。复染 滴加石炭酸复红染色液染色约30秒，水洗。 3. 干燥 自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。4镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。并判断菌体的革兰氏染色反应性。注意：1革兰氏染色的关键是脱色时间。脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色误认为是革兰氏阴性菌，脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。 2染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水以免染色液被稀释而影响染色效果。（三）芽胞染色法1涂片，干燥，固定见普通染色法。2. 染色 加5孔雀绿水溶液于玻片上，用微火加热至染色液冒蒸汽，维持约5分钟，（期间需添加染色液，添加前须冷却，加热火焰要小），冷却后水洗。 用石炭酸复红染色液染30秒后水洗。3.干燥 自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分(注意勿擦去菌体)。4.镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。注意芽胞和营养体各自的颜色。（四）荚膜染色法方法一：1.涂片、干燥见普通染色法。但干燥只能在空气中自然干燥。2.染色 用结晶紫染色液染1-2分钟。用20CuSO4溶液冲洗结晶紫，至不再有紫色洗下来为止。（不要再用自来水洗）。 3.干燥 空气中自然干燥。4.镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜浅紫色。方法二：1.涂片、干燥见普通染色法。但干燥只能在空气中自然干燥。2.染色 加石炭酸复红染色液染1分钟，水洗、晾干。滴加少量黑色素于玻片一端，另取一块边缘平整的载玻片顺势将黑色素从涂片表面刮过（图3-2）。注意，黑色素要用得少，使刮过的黑色素成很薄一层，干燥快。 3.干燥 空气中自然干燥。4.镜检 用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。结果：背景呈黑色，菌体与背景之间无色的透明区即为荚膜。（五）鞭毛染色法1.菌液的制备 将已活化3-5代的变形杆菌接种于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面上(斜面内在接种前加少量肉汤)，37培养6-8小时，加入灭菌生理盐水1ml轻轻摇动使之成为悬液。 将此悬液在28-30培养箱中保温15-20分钟。2.涂片 吸上述菌液一环于洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，自然形成一薄层，用吸水纸吸去多余的菌液。3.干燥 放在空气中自然干燥（不能加热干燥）。4.染色 滴加鞭毛染色液染色5-10分钟后，小心水洗。5.镜检 自然干燥后，用油镜观察所制的标本片并绘出其形态图。五、观察记录将你在显微镜里看到的景象绘图表示，并加以说明。六、思考题1. 芽胞染色加孔雀绿时要加热，而在鞭毛染色、荚膜染色却又不能加热，为什么？2. 你如何判断视野中的景象是否确系标本？