总抗氧化能力测定(FRAP法)[一类严选].doc

小麦叶片总抗氧化能力测定（FRAP法）一、 实验原理FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tri-pyridyl-tria-zine(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10M，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。 AntioxidantFe3+-TPTZ（橘黄色）> Fe2+-TPTZ (蓝色)二、 实验步骤1. FRAP工作液配制：0.3 M pH 3.6 醋酸缓冲液：0.364g无水醋酸钠+3.2mL冰乙酸定容至200mL，用1M HCl调节pH至3.6；10mmol/L TPTZ溶液25mL：0.078g TPTZ用40mM 盐酸溶液定容至25mL；20mmol/L FeCl3溶液50mL：2.78g用RO水定容至50mL；上述溶液以10:1:1的比例混合（现配现用）。2. 取叶片0.1g，加入2.5mL蒸馏水研磨稍沉淀后取1.5mL 12000g离心10min（4oC），取上清液。3. 在反应管中加入100uL上清液，再加入2.4mL工作液，37 oC条件下水浴10min，于593nm处测定吸光度，4. 标准曲线绘制：以0.1-1.6mmol/L的FeSO4的标准液替代样品绘制标准曲线。三、 结果计算以1.0mmol/L的FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度值为一个FRAP值，计算结果。1Benzie I F F, Strain J J. The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power”: The FRAP AssayJ. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1):70-6.2 Katarzyna Szafraska, Rafa Szewczyk, Krystyna Maria Janas. Involvement of melatonin applied to Vigna radiata, L. seeds in plant response to chilling stressJ. Central European Journal of Biology, 2014, 9(11):1117-1126.2兰花书屋