蛋白激酶A参与抗胆碱药物快速抗抑郁作用机制研究.docx
蛋白激酶 A 参与抗胆碱药物快速抗抑郁作用机制研究 研究背景: 抑郁症严影响着着人类的健康 , 并给公共卫生事业带来巨大的负 担。目前抑郁症的发病机制仍不十清楚确 , 治疗现状并不理想。当前临床经典抗抑郁药多针对单胺类神经递质系统进行调控来发挥作用。 这 类药物普遍起效缓慢 ,往往需要数周乃至数月才见效 ,且疗效不佳 ,并可能增加患 者自杀、致残的风险。因此, 开发新型快速的抗抑郁药物具有着十分重要的临床和社会意义。近年 来,研究发现,在亚临床剂量下，非选择性M型胆碱能受体阻断剂东莨菪碱具有快 速而显著的抗抑郁作用 , 但其具体作用机制尚不明确。相关研究发现 , 与其他具有快速抗抑郁作用的药物类似 , 东莨菪碱通过增强AMP；受体功能,一过性地激活m TOR通路,进而重塑慢性应激导致的突触传递障 碍。然而东莨菪碱究竟通过何种机制增强 AMP废体的功能,以及自阻断M受体到 激活m TOF信号通路之间的胞内事件尚不明确。对这个问题的研究和说明 , 将有助于揭示抗胆碱类药物快速抗抑郁的作用机 制,并为开发新型快速平安的抗抑郁药物奠定理论根底。 目的:本研究通过电生理 技术, 脑立体定位手术 , 急性海马脑片孵育 , 细胞膜蛋白提取 ,Western blot, 习得 性无助 (Learned helplessness,LH) 抑郁模型以及抑郁样表现的行为学检测等方 法,探讨蛋白激酶A参与东莨菪碱对AMPAS体的增强以及激活mTOR!路的上游 机制,并比较东莨菪碱与其他特异性 M受体阻断剂的作用效果，为揭示快速抗抑 郁药物作用机制和开发新型快速平安的抗抑郁药物提供重要的实验依据。方法:1、采用大鼠习得性无助 (learned helplessness,LH) 应激方法建立抑 郁模型,并通过相关行为学实验 (强迫游泳,开放旷场,糖水偏爱)检测造模效度。 2、 分别用0,10n M,100n M,1卩M,10y M浓度东莨菪碱溶液灌流应激后大鼠脑片,检 测东莨菪碱促进Glu A1 Ser845及m TOR Ser2448位点的磷酸化水平的作用与其 浓度的关系。3、利用电生理技术，在NMDAe体的阻断剂APV孵育并灌流海马脑片的根底 上,给予东莨菪碱1卩M灌流,记录CA1辐射区兴奋性突触后场电位SC-CA1 f EPSP的变化，并以PKA的选择性的阻断剂H891卩M预孵育并灌流脑片，观察其 对东莨菪碱这一作用的影响。 4、急性别离的海马脑片予以东莨菪碱或合并 H89 进行孵育 ,用细胞膜蛋白提取技术别离膜蛋白进行 Western blot 检测,研究东莨 菪碱及H89对Glu A1和Glu A2膜表达水平的影响。5、在经过GABAe受体阻断剂picrotoxin100卩M预处理的海马脑片上,再给予东莨菪孵育,观察CA1区Glu A1 Ser845和mTORSer2448的磷酸化和Glu A1 表达的增加作用是否被GABA阻断剂所完全掩盖。6、通过立体定位置管手术, 习得性无助大鼠侧脑室提前注射 H89或人工脑脊液，然后腹腔注射东莨菪碱，或 侧脑室注射M2受体选择性阻断剂美索拉明，取海马CA1区进行western blotting 检测, 观察东莨菪碱活体给药对 Glu A1 总蛋白,以及 Glu A1 Ser845 和 m TOR Ser2448磷酸化水平的作用,以及H89预处理对该作用的影响。7、同上，侧脑室提前注射H89或人工脑脊液,再注射M2受体选择性阻断剂美 索拉明 , 进行 western blotting 检测, 观察其对海马 Glu A1 总蛋白 , 以及 Glu A1 Ser845和m TOR Ser2448磷酸化水平的作用，以及H89预处理对该作用的影响。8、习得性无助大鼠侧脑室提前注射 H89或人工脑脊液，随后给予东莨菪碱和美索 拉明 , 进行强迫游泳和开放旷场检测 , 验证其活体条件下对抑郁样行为的作用 , 以 及该效应是否受H89影响结果:1、通过不可逃避足底点击应激，成功构建了 SD大鼠习得性无助模型。2、急性海马脑片上 , 东莨菪碱剂量依赖地增加海马 CA1 区 Glu A1 Ser845 的磷酸 化和 Glu A1 总蛋白的表达。东莨菪碱在1卩M的浓度下增加mTORSer2448的磷酸化；在其他浓度那么未见 明显激活。3、东莨菪碱在APV(100y M)孵育和灌流下,依然能够快速增加海马 SC-CA1兴奋性突触后场电位的幅度。这一效应可被蛋白激酶 A的特异性拮抗H89阻断。4、东莨菪碱可以快速增 加海马脑片CA1区胞膜Glu A1表达，该作用可以被H89所阻断。Glu A2膜表达那么未受东莨菪碱和H89明显影响。5、GABA阻断剂不能掩盖 东莨菪碱介导的Glu A1 Ser845和m TOR Ser2448位点的磷酸化增加。但经过GABA0S断剂预处理的脑片上,未能观察到东莨菪碱进一步增加 Glu A1总蛋白的水平。6、LH大鼠腹腔注射东莨菪碱可以增加海马 Glu A1总蛋白水 平； 这一效应不依赖于 PKA。同时,东莨菪碱促进Glu A1 Ser845和m TOR Ser2448位点的磷酸化。该效 应需要PKA途径参与。7、LH大鼠侧脑室注射美索拉明可以同时增加海马Glu A1 Ser845和m TORSer2448位点的磷酸化。该效应需要 PKA途径参与。但经美索拉明和H89急性给药后，未观察到Glu A1总蛋白水平发生明显变化。 8、LH大鼠腹腔注射东莨菪碱或侧脑室注射美索拉明都可以缩短强迫游泳实验中 的不动时间,而不影响旷场试验中的自主活动能力。结论:1、PKA对于在东莨菪碱激活 AMPAS体和mTOF通路,及发挥快速抗抑郁作用是必须的,其可能是通过磷酸化Glu A1 Ser845,促进AMPAS体上膜实现 上述作用。2、东莨菪碱介导的Glu A1总蛋白快速表达增加不依赖 PKA但受GABAa 受体调控。3、 选择性M2受体阻断剂美索拉明可以起到类似于东莨菪碱对于 Glu A1和 m TOF的磷酸化作用,以及快速抗抑郁效果,这些作用依赖于PKA通路。这提示, 对M2受体的抑制作用可能参与东莨菪碱激活 PKA以及后继信号通路的机制。4、与东莨菪碱不同 , 美索拉明不影响 Glu A1 总蛋白表达。提示单独的 M2-PKA 机制短时间内缺乏以促进 Glu A1 快速合成。
