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龙眼LEAFY同源基因启动子的克隆与序列分析-论文网论文摘要：为了解龙眼LEAFY同源基因（LLFY）的表达调控规律，本研究应用染色体步移方法克隆了809bp 的LLFY启动子序列。用在线软件PlantCARE分析表明，该序列除含有启动子基本元件，如TATA-BOX、CAAT-BOX外，还含有参与生理周期调控、干旱诱导MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件等一些其他的调控序列，推测LLFY的表达受生理周期、干旱、光照等的调控。用 FootPrinter在线工具对龙眼等6个物种的 LEAFY同源基因启动子进行比较, 发现不同植物的启动子具有保守性, 也存在差异, 表明LEAFY同源基因功能上的分化，LLFY基因具有多种功能。论文关键词：龙眼,同源基因,启动子,序列分析LEAFY（LFY）基因是拟南芥中的花分生组织特性基因，在营养生长向生殖生殖转变过程起主要的调控作用，被认为结合了内外开花的诱导因素，是启动开花的枢纽。目前已知拟南芥中LFY的表达调控主要有长日照诱导、GA诱导、低温春化以及自动途径等四条途径，LFY的表达还受microRNA作用的调控因子SPL3的直接调控。木本植物的成花诱导与草本植物存在差异，对木本植物LFY同源基因表达调控的了解还十分有限。对不同物种LFY同源基因的研究表明，LFY同源基因作为花分生组织特性基因的功能是保守的，但在功能上出现分化。基因的启动子序列与基因的表达调控密切相关，研究表明具有MADS结构域的调控因子SOC1直接与LFY的启动子结合调控LFY的表达，结合部位在LFY启动子的近端和远端两个位置，这两个位置含有CArG盒（其中心序列为CCWGG）。研究结果还显示同时与LFY启动子结合的还有调控因子AGL24，AGL24与SOC1结合在同一位置，SOC1的结合需要AGL24的配合。此外，LFY启动子的近端区域被认为含有应答GA的顺式作用元件。宗成文等分离了葡萄LFY基因的启动子片段，对序列进行分析并与拟南芥、烟草等LFY基因的启动子进行比较，结果表明LFY同源基因启动子中转录元件是相对保守的，但也存在差异。龙眼(DimocarpuslonganL.)是重要的亚热带果树，生产上存在“大小年结果”和“冲梢”等问题，都与花芽分化密切相关。研究表明，龙眼LFY同源基因（LLFY）的功能与龙眼花序的分化和维持有关，在“冲梢”过程LLFY表达量下降，LLFY在叶芽中也有微弱表达。为进一步了解LLFY的功能和表达调控规律，本研究克隆LLFY上游的启动子序列并进行序列分析，为阐明龙眼花芽分化的分子机制提供依据。1材料与方法1.1试验材料试材为红核子龙眼成年树幼嫩叶片，取材自福建农林大学校园。1.2龙眼叶片基因组DNA的提取龙眼叶片基因组DNA的提取参照曾黎辉等的方法。1.3染色体步移克隆LLFY5´端启动子序列染色体步移使用TaKaRa公司的LAPCRinvitroCloningKit。首先，对已获得的LLFY基因组DNA序列进行分析，选用XbaI对龙眼基因组DNA进行酶切，然后与试剂盒提供的相匹配的接头连接；试剂盒提供相应的两条接头引物（F1、F2），根据已知的LLFY序列设计两条3´端引物R1和R2，R1：GGCAGCAGAGAGATGTAGGTTTGCTAT，R2：GCTGCTGTTTCTGTGTTCACGATACTG；以加接头的酶切产物为模板，进行两轮PCR扩增；第一轮PCR扩增条件为：94预变性3min，94变性30s，56退火2min，72延伸2min，35个循环，72延伸7min；第二轮PCR扩增条件为：94预变性3min，94变性30s，60退火2min，72延伸2min，35个循环，72延伸7min；将获得的片段回收、纯化，与PMD18-TVector（购自TaKaRa公司）连接，转化，蓝白斑筛选后测序委托上海博亚英骏生物技术有限公司测序。1.4序列分析用DNAMAN软件拼接序列。应用在线软件PlantCARE对LLFY启动子序列进行转录元件分析，寻找转录因子结合位点(transcriptionfactor-bindingsites,TFBS)。在GenBank数据库中查找拟南芥、水稻、葡萄、山核桃、芒果等5个物种的LFY同源基因的启动子序列，应用在线FootPrinter3.0软件对这几个物种以及LLFY的启动子序列进行比较。2结果与分析2.1LLFY启动子的克隆采用染色体步移方法进行两轮PCR的扩增后，获得了一条约700bp特异性片段（图1），测序结果表明该PCR产物大小为683bp，图2中下划线部分为启动子序列。将克隆到的序列与先前获得的LLFY部分5´端非编码区序列进行拼接，得到LLFY起始密码子ATG上游的启动子序列共809bp，结果见图2。图1龙眼LLFY基因启动子第二轮PCR扩增产物M.DL2000marker;1.PCR扩增产物Fig.1SecondroundPCRproductofLLFYpromoterinlonganM.DL2000marker,1.PCRproduct2.2LLFY启动子序列的分析首先用PlantCARE软件在线分析LLFY启动子区域的转录因子结合位点（TFB）及其功能，结果见表1。从表1可以看出，809bp的LLFY启动子片段中在-125等4个位置含有典型的TATA-box序列，在-98等6个位置含有CAAT-box序列，TATA-box和CAAT-box是启动子区域的基本顺式作用元件；在此序列中还发现在-595处有一个与生理周期调控有关的顺式作用元件，说明LLFY的表达与植株的生理周期有关；-182位置是厌氧诱导的顺式元件，序列中还有4个干旱诱导的MYB结合位点、1个光诱导MYB位点和ABA响应元件(ABRE)，这些调控序列的存在表明LLFY的表达可能受干旱、光照、氧气等环境因素以及激素ABA的调控。