黄河故道地区葡萄根结线虫病原的形态和rDNA ITS-PCR分子鉴定-论文网.docx

黄河故道地区葡萄根结线虫病原的形态和rDNA ITS-PCR分子鉴定-论文网论文摘要：采用病原形态鉴定方法和根结线虫核糖体基因内转录区保守序列的的PCR鉴定方法，对采自我国黄河古道区域葡萄根结线虫病株进行了病原物分离，进行根结线虫的形态鉴定分子鉴定。对线虫二龄幼虫的核糖体DNA进行了分离，利用通用引物18S和28S，采用PCR技术对分离到的根结线虫的核糖体基因（ribosomal DNA, rDNA）内转录间隔区（Internal Transcribed Spacers, ITS）保守序列进行扩增，获得片段长度约为766bp，并进行了序列分析。在NCBI上对其序列进行了同源性比较，结果表明，从黄河故道地区分离的葡萄病原线虫与南方根结线虫ITS序列同源性达到100%，结合形态鉴定分析，证明黄河故道地区的葡萄根结线虫病害病原为南方根结线虫。论文关键词：葡萄,根结线虫,南方根结线虫,核糖体基因,内转录间隔区*通讯作者。Authorforcorrespondence.Tel:,E-mail:honglianliwereusedtocomparethesequencebysoftwareBLASTnandBLASTx.Theresultshowedthattheidentityoftwosequencereach100%.Thisindicatedthatthepathogenofroot-knotdiseasewasM.incognitaintheareaofeastYellowRiverregion,anditalsoindicatedthatthedetectionresultaccordingtotheprocedurewasreliable.葡萄根结线虫病是制约葡萄生产的世界性病害，危害日益严重，轻者造成减产，严重时毁园。自1889年Neal首次报道加州的葡萄发生根结线虫病，为害葡萄的根结线虫在世界分布的主要有四种：南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫(M,hapla)。另外在法国有M.marioni，在意大利有泰晤士根结线虫(M.thamesi)。近年来，随着分子生物学技术在线虫鉴定中的应用，分子鉴定已应用于根结线虫的分类鉴定中并取得了很大的进展。关于根结线虫的分子鉴定，前人已作出了很大的工作。葡萄根结线虫病在黄河古道地区普遍发生，对葡萄生产和育苗造成很大的危害。只有在明确其具体种类后，才能进一步深人开展其它方面的研究，如线虫与寄主间的分子互作、抗线虫基因的筛选和利用，以及有效的防治方法等。因此，准确鉴定本区域内病原线虫的种类具有极其重要的意义。我们对黄河古道地区的葡萄感病病株根结进行了病原线虫的分离培养，从形态学和分子生物学两方面对其进行鉴定，以明确黄河故道地区的葡萄根结线虫种类，为线虫病害防治以及今后研究工作提供参考。1材料与方法1.1材料葡萄根结线虫病病原线虫的来源和分离：河南洛阳孟津、郑州郊区、开封陈留、商丘平台、安徽砀山果园场、萧县等6个不同地区采集线虫感染的葡萄根系，带回试验室，用强水流冲洗，选择膨大根结，挑取成熟雌虫和卵囊备用。1.2方法1.2.1根结线虫形态鉴定将成熟卵囊置灭菌水中，25培养24小时。收集二龄幼虫，在显微镜下观察其形态并照相。挑取成熟雌虫，观察其形态并照相。根据致病症状和线虫形态进行初步判断。判断标准参照刘维志等方法进行。1.2.2根结线虫rDNA提取参考彭德良等的方法并加以改进，具体方法为：挑取1个成熟卵囊放入灭菌的Eppendorf管中捣碎，加入10L灭菌重蒸水，25培养24小时，充分搅匀后去杂质，-20冷冻2h，用灭菌牙签的端部充分研磨2-5min，再加入9L蛋白酶K溶液（1mg/ml）(Promega,USA)，离心30s，继续-20冷冻2h，将Eppendorf管置65下温浴1h，9510min，最后12,000r/min离心1min，取上清DNA悬浮液-20保存备用。1.2.3ITS-PCR扩增采用ITS片段的PCR扩增方法可以鉴定根结线虫，所用扩增引物为南方根结线虫rDNA的ITS区通用引物：引物1（18S）：5-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3引物2（28S）：5-TTTCACACGCCGTTACTAAGG-3具体方法为：采用50L的PCR反应体系：10×PCRBuffer5L，引物各1L，模板DNA10L，PremixTaqDNA多聚酶25L，灭菌重蒸水补足到50L。同时设置无线虫DNA阴性对照，重复6次。EppendorfPCR扩增仪上进行扩增。扩增条件为：944min；9430s，511min，721min，30个循环；7210min，4保存。DNA扩增后离心，取10L扩增产物加1L加样缓冲液在1.0%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，150V下电泳40min,紫外光下观察和照相。1.2.4PCR产物的回收PCR产物采用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，具体操作步骤参照试剂盒操作说明。1.2.5PCR产物的克隆、测序和序列分析将纯化后的PCR产物与PGEM-TEasyVec-tor在4下连接1216h，采用热击法转化到通过CaCl法制备的E.coliDH5a感受态细胞(TIANGEN公司)中。在含有Ampicillin(100mg/L)，IPTG(24mg/L)和X-gal(200mg/L)的LB筛选平板上挑取单个白色菌落于含有Ampicillin(10mg/L)的液体LB中摇培过夜。