实验四--大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定.docx

实验四大黄中游离慈酿类成分的提取、分离与鉴定一、概述植物来源：大黄系蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L .)、唐古特大黄 (Rheumtanguticum Maxim. ex Balf .)或药用大黄(Rheum offcinale Baill .)的干燥根及根茎。 大黄记载于神农本草经等许多文献中，具有泻下、健胃、清热解毒等功效。自古以来， 大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一味很早就被各国药典收载的世界性药材。功效：大黄具有多方面的生物活性，其抗菌、抗感染及抗肿瘤活性有效成分主要为意 醍类衍生物，如：大黄酸、大黄素和芦荟大黄素；止血的主要有效成分为大黄酚；泻下的有 效成分是结合型的慈昔类。葱醍类衍生物占大黄总化学成分的3%5%,该类成分少部分以游离状态存在，大部分与葡萄糖结合成昔的形式存在。此外，大黄还含有糅质等多元酚类化合物，含量在10% 30%之间，具止泻作用，与慈昔的泻下作用恰恰相反。主要化学成分的结构及物理性质大黄中含有多种游离的羟基慈醍及其与糖所形成的昔类化合物，已知的游离羟基慈醍主要有以下5种化合物。大黄酸OTOHH大黄素OHch3芦荟大黄素CH20HH大黄素甲醛OCHaCHj大黄酣CH3H大黄酸(rhein) , Ci5H806,黄色针晶，m.p321 322 C (330 C分解),UV入 max431 , 258, 231 , 204。可溶于碱水，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醛和石油醒，不溶于水。大黄素(emodin) , C5H。05,橙黄色针晶(乙醇)，m.p256 257C。UV入 max436, 289, 266, 253, 222。可溶于碱水，微溶于乙醛、三氯甲烷，不溶于水。芦荟大黄素(aloe emodin),橙色针晶(甲苯)，m.p223224 C。UV入 ma429, 287, 254, 225, 202。可溶于乙醛、苯及碱水，不溶于水。大黄素甲醛(physcion),砖红色单斜针状结晶(苯),m.p205207C。溶于苯、三氯甲 烷及甲苯，不溶于甲醇、乙醇、乙醛和丙酮，不溶于水。大黄酚(chrysophano1) , -04,橙黄色针晶(乙醇或苯),m.p195 196C。UV入 ma>429, 287, 256, 225, 202。可溶于丙酮、三氯甲烷、苯、乙醛和冰醋酸和碱水，微溶于石油醛， 不溶于水。大黄酸葡萄糖昔(rhein 8-monoglucoside) ,黄色针晶。m.p266267C。大黄素葡萄糖昔(emodin monoglucoside),橙色针晶(甲苯)。m.p190 191C。芦荟大黄素葡萄糖昔 (aloeemodin monoglucoside) ,黄色针晶。m.p235C。大黄酚葡萄糖昔(chrysophanol monoglucoside) ,橙色针晶(甲苯)。m.p239C。二、实验部分（1） 实验目的要求1掌握蒽醌苷元的提取方法双相酸水解法。2.掌握梯度PH萃取法提取分离大黄中各种葱醍昔元的原理及操作方法。3掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱鉴别方法。（2） 实验的基本原理1 提取原理双相酸水解法， 为一相为与酸水不相互溶的有机溶剂， 另一相为酸水， 加热回流水解的方法。 由于大黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在， 所以首先要将苷水解成苷元， 本实验选用硫酸和乙酸乙酯作为双相酸水解的溶剂， 采用加热回流方法， 提取大黄药材中的游离蒽醌类化合物。根据苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中， 稀硫酸可将蒽醌苷水解成苷元， 游离出来的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯中，从而将蒽醌苷元提取出来。2 分离原理pH 梯度萃取法羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用 pH 梯度法进行分离。具有羧基或多个3位酚羟基的葱醍可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有一个3位酚羟基的葱醍可溶于5%碳酸钠溶液，只具有“位酚羟基的葱醍，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。以分离酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离（1）大黄中游离葱醍的酸性强弱顺序大黄酸（一COOH）大黄素（酚酚一OH）渭荟大黄素（醇一OH）汰黄素甲醛（一OCH）大黄酚（一CH）。（2） 大黄中游离蒽醌的极性大小顺序大黄酸大黄素芦荟大黄素大黄素甲醚大黄酚。大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。（3） 实验方法1总蒽醌苷元的提取、分离工艺流程大黄药材（粗粉）5的如 刘HzSO/OOnl.三氯甲烷250向,水浴回流4h,梢冷后过渡三氯甲烷提取液陵水层先用蒸海水洗2次（每次20ml），再用pHfi缓冲溶液200ml.振摘革取一次三氯甲烷层HCI调pHZ，冰箭酸精制pH 10缓冲溶藻300ml,振播整取二次沉淀物（黄色结匾） （大黄酸）眼水尾三氯甲烷层HC】阔pH工闪酮精犒沉淀物1班缢晶）大黄索）pH 13(,%N打CO5%NmCH)缓冲溶液200wL振据萃取二次三氟甲烷层用80ml三氯甲烷网洗1次3d oNaOH 50Gml萃取一收沉淀物（橙黄色结晶）芦荟大黄霜）睡水层三甄甲烷大黄龄操作注意事项HCI调pH3.过滤沉淀物硅胶柱色谱"1大黄素甲m所得乙酸乙酯液中若带有酸水液,应用分液漏斗分出弃去；此处用蒸储水洗除乙酸乙酯液中的酸。萃取时容易发生乳化， 而且随着碱液碱度的增高，乳化现象会越严重， 所以要轻轻振 摇。每次加碱液进行 pH梯度萃取时，注意要测一下乙酸乙酯液的pH。萃取时一定要注意乳化层的分出，不要混入。2总蒽醌苷元的提取大黄粗粉 50g， 置 500ml 烧瓶中， 加 20硫酸溶液100ml 和乙酸乙酯250ml ， 水浴回流提取 2 个 h (加磁子搅拌) ，放置，冷后过滤，残渣弃去，乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水层，乙酸乙酯提取液用蒸馏水洗2 次(每次 20ml )，将乙酸乙酯液放置在锥形瓶中，密封。3.游离蒽醌的分离与精制(1)大黄酸的分离和精制将乙酸乙酯提取液置500m1分液漏斗中，用 5%NaHCO3溶液萃取三次(80ml, 60ml,40ml),合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节 ph =2,放置，待沉淀析出完全后，过滤， 并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60 干燥，得深褐色粉末， 主为大黄酸。 沉淀干燥后，样品加冰醋酸10ml 加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。(2) 大黄素的分离和精制经NaHCO3溶液提取过的乙酸乙酯液，继用5%Na2CO3溶液萃取三次，每次用量40ml, 合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节 ph=2,析出棕黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出 液呈中性，60干燥，沉淀经干燥后，用15ml 丙酮热溶，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。(3) 芦荟大黄素，大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离经Na2CO3提取过的乙酸乙酯液，再用 5%NaOH溶液提取三次，每次用量40ml,合并后的碱液同( 1 )法处理，所得产品为黄色粉末，为芦荟大黄素、大黄酚和大黄素6甲醚的混合物。3. 游离蒽醌类化合物的鉴定(1) 化学鉴定碱液试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，加lml 乙醇溶解，加10氢氧化钠溶液数滴，观察颜色变化。羟基蒽醌类应呈红色。醋酸镁试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，各加乙醇lml 使溶解，滴加0 5 醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。(2) 色谱鉴定 薄层色谱鉴定吸附剂：硅胶 G- CMC-Na板。样 品：上述分别获得的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的三 氯甲烷溶液及各相应对照品的三氯甲烷溶液。展开剂：石油醚乙酸乙酯醋酸 (2 ： 1 ： 0.2) 。 展开方式：上行展开。显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏或喷5醋酸镁甲醇溶液，斑点显红色。实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf 值。四、注意事项大黄中蒽醌类化合物的种类、 含量与大黄的品种、 采集季节、 炮制方法及贮存时间均有关系。由于蒽醌类衍生物主要以苷的形式存在，所以较新鲜的原药材蒽醌类成分含量高，如果是贮存时间长的饮片，则蒽醌类成分含量低，实验选材要注意。用碱液萃取时要注意浓度和用量，酸化时，加酸要慢，多搅拌。分液漏斗的正确使用。五、思考题1简述液液萃取法的原理、溶剂选择原则和操作技术。2 什么叫双相酸水解?掌握其原理和用途。3 大黄中 5 种游离羟基蒽醌化合物的酸性和极性与结构有什么关系 ?4 pH 梯度萃取法的原理是什么 ?该法适用于哪些中药成分的分离?5 蒽醌类化合物及其甙的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂 ?6 . 蒽醌类与醋酸镁显色反应的必要条件是什么?其颜色反应与羟基所在的位置有何关系 ?参考文献1 杨其菖主编天然药物化学北京：中国医药科技出版社， 1998， 84-872 李嘉蓉主编天然药物化学实验北京：中国医药科技出版社， 2000 ， 543陈德昌主编中药化学对照品工作手册北京：中国医药科技出版社，2000， 42-46 ， 974 刘桂芳主编中药化学实验及技术沈阳：辽宁大学出版社， 1995， 205-213 ， 2655阚毓铭等，中药化学实验操作技术，北京，中国医药科技出版社， 1988， 145 页6 康延国 主编，中成药薄层色谱鉴别，北京，人民卫生出版社， 1995 ， 29 页