药物体外3T3 细胞光毒性（中性红摄入）评价方法的建立.doc

药物体外3T3 细胞光毒性（中性红摄入）评价方法的建立涂宏刚 欧红梅 黄鹏程 顾珺 常艳 基金项目：上海市科委科研计划项目基金资助，11DZ2292100*通讯作者：常艳，女，药物毒理学博士，硕士生导师，主要从事遗传毒理和生殖毒理研究。Email: ychang，联系电话：021-50800333 （国家上海新药安全评价研究中心，郭守敬路199号，上海201203）目的：采用Balb/c 3T3小鼠成纤维细胞建立符合国际规范的体外光毒性评价方法（3T3 中性红摄入试验），并通过评价光毒性资料明确的药物验证该方法的可靠性，为该方法在药物临床前光毒性评价的推广及其在新药研发过程中的应用提供支持。方法：将生长状态良好的Balb/c 3T3细胞接种于96孔培养板（外围一圈除外），使每孔含有100 µl密度为1.0×105个/ml的细胞悬液。在37，5%的CO2条件下培养约24小时后，除去培养基，以平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞2次后，每孔加入100 L含有不同浓度盐酸氯苯嗪、盐酸胺碘酮和蒽的HBSS溶液，同时设置空白对照和溶媒对照，每个处理3个复孔，每种受试物2块板。将培养板置于37±1、5%±1% CO2条件下加湿培养约1小时后，将光照板置于光强度为1.7±0.1 mw/cm2 的UVA条件下照射至剂量达5.0 J/cm2，无关照板用锡箔纸包裹后于室温暗室条件下培养相同时间。光照结束后，除去含供试品（对照品）的HBSS溶液，用150 L预热的HBSS洗涤细胞2次后，换上新鲜的培养液继续培养18-22小时。培养结束前约3小时，加入含50.0 g/mL中性红无血清的DMEM培养液继续培养。培养结束后，弃去含中性红的培养基，用150 L预热的HBSS洗涤细胞，然后每孔加入150 L中性红洗脱液，置于振荡器快速振荡直至形成均匀的溶液。用分光光度计在540 nm下测定各孔的OD值（OD540）。以Phototox软件计算光刺激因子（PIF）值。结果：在本试验条件下，盐酸氯苯嗪、盐酸胺碘酮和蒽的PIF值分别为27.5、5.9 和大于25.1，与指导原则OECD432中的参考数据一致。结论：本试验条件下，盐酸氯苯嗪、盐酸胺碘酮和蒽的光毒性数据与文献报道具有良好的一致性，因此认为本研究成功建立了符合国际规范的体外3T3 细胞光毒性（中性红摄入）评价方法，可用于药物早期光毒性体外筛选和临床前光毒性评价。