05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精).doc

天津现代职业技术学院 1 3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定糖化酶活力 一、原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解 a -1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被 3,5-二硝 基水杨酸（DNS）氧化成葡萄糖酸，而 3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的 3-氨基 -5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关 系，利用分光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便 可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。 由于多糖水解为单糖时，每断裂 一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。 反应过程如下： NH, CH I_/ COOH N0t 二、仪器、试剂 1、仪器 1） 具塞玻璃刻度比色管：25mLX 19; 2） 烧杯：100mLX 4; 3） 三角瓶：100mLX 1; 4） 容量瓶：100mLX 3，50mLX 3; 5） 刻度吸管：1mLX 4; 2mLX 3; 10mLX 1; 6） 沸水浴； 7） 冰浴； 8） 扭力天平； 9） UV2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司; CJOH r i 0J1 on CH.OK OH in ND, OH CHtOH ZLOH / CH.OH -0 + 从0#1霹4 M 天津现代职业技术学院 2 2、试剂 1) 1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80C烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg 置于小烧杯中，加少量蒸馏 水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL 混匀，4C冰箱中 保存备用。 2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS 试剂 将 6.3g DNS 和 262mL2M NaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热 水溶液中， 再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠， 搅拌溶解， 冷却后加蒸馏水定容至 1000mL贮于棕色瓶中备用。 三、操作步骤 1、葡萄糖标准曲线的绘制 取 7 支 25mL 具塞刻度比色管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄 糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸(DNS 试剂，配成不同葡萄糖含量的反 应液。 AvV 口 吕号 1mg/mL 葡萄 糖标准液(mL 蒸馏水 (mL) DNS (mL) 葡萄糖含量 (mg) 光密度值 (OED40 nm) 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 表 1 葡萄糖标准曲线制作 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5mi n，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏 水定容至 25mL 加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm 用 0 号管调零点，测出 16 号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量( mgj) 为横坐标，做出标准曲线。 2、糖化酶活性测定 1)将糖化酶粉剂或浓缩液稀释至 2040 单位/毫升，制成酶制备液； 天津现代职业技术学院 3 2） 取甲、乙两比色管（50 毫升），分别加入 2 刑溶性淀粉溶液 25ml 和 0.1M 醋酸-醋酸钠缓冲溶液 5ml，摇匀，放入 40C 士 0.2 C的恒温水浴锅中水浴 5-10 分钟； 3） 在甲管中加酶制备液 2ml,摇匀，并记录时间，反应 10 分钟后,立即加入 20% NaOH 溶液 0.2 毫升,摇匀； 4） 将两管取出冷却，并于乙管中补加入酶制备液 2 毫升（作为空白对照）； 5） 取上述反应液 2 毫升放于盛有 2 毫升 3,5 一二硝基水杨酸的 25 毫升比色 管中,按工作曲线的步骤以乙管为空白测其吸光度。 由吸光度值从工作曲线上查 得葡萄糖的毫克数，再按下面的公式计算酶活力单位。 四、计算 以 1 克酶粉剂或 1 升发酵酶液在 40C时 pH 为 4.6 条件下,1 小时分解可溶性 淀粉产生 1 毫克葡萄的酶量定义为一个酶活性单位。 酶活力单位=相当于测得吸光度的葡萄糖毫克数舟菁器n k 式中：1/2 一折算成 1 毫升酶液的量； 3 2.2 一反应液总体积的毫升数， （2） 一吸取反应液毫升数； 60/10 一转化成 1 小时的活性 n 稀释倍数； k 一常数（包括时间,双糖影响等）