EMSA试验成功的关键因素.docx
EMSA试验成功的关键因素:1.1 . 试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC790卷田胞，就是因为时间点设计的不好 EMSA试验结果 是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果 !所以这个设计很关键!给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h 之间，很多时候都是在45min 和 1h达到高峰，当然还有合适的浓度！二是是你用的是药物刺激产生受体可能 时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些 ,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2 .核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1 . 注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2 .掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度.能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的！ 一般要求在1ug/ul 以上 !有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果.这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织,细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多.而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!3 .探针的制备:又很多站友都在问我生物素标记到3端还是5端 ,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度,国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下:合成寡核苷酸-标记生物素-纯化-退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4 .EMSA实验技术.这一点主要是操作的细节问题！下面会更细的谈到.技术要点: 八、关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了！1.制胶必须是非变性PAGE凝胶，我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果！一般控制在5分钟凝固的效果 .10X TBE1.0ml40% Acrylamide（ 40%聚丙烯酰胺）3.3ml50% Glycerol（ 50%甘油）1.0mldH2O （蒸储水）14.8mlTEMED （四甲基乙二氨）20 口 l脱气 10min10% AP （过硫酸氨）120区l总量20.0ml2.一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer （10X结合反应液）（-20 oC）l Poly （dI:dC） （dI:dC）（聚核甘酸竞争物）（-20 oC）l 6X Loading Buffer （10X上样缓冲液）（4 oC）l Cold oligonucleotides （非标记竞争Ti寡核甘酸）（-20 oC）l Biotin-Labeled Probe （生物素标记探针）（-20 oC）l Streptavidin-HRP （链霉亲核素-HRP （4oC）l 2 x Blocking Buffe2 对闭?夜）（4 oC）l 5 x Washing Buffe5 就涤?ft） （4 oC）l Equilibration Solution （平衡液）（4 oC）l Binding-membrane （结合反应膜）（RT）3.结合反应每次结合反应需1-5小核蛋白（根据核蛋白浓度而定），根据不同的核提取物 浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸储水将终体积调节到15区l（ 1）结合反应体系：10X结合反应液1.5 区 lPoly（dI:dC）（dI:dC)1.0 w l细胞核提取物*?履双蒸水* ? 11混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针0.5 区 1总量15区1混匀室温静置20 分钟或以上。( 2)特异性反应确认竞争反应体系：10X结合反应液1.5 区 1Po1y(dI:dC)(dI:dC)1.0 区 1细胞核提取物？ w 1未标记的竞争性寡核2.0 区 1双蒸水* ? 11混匀室温静置20 分钟生物素标记的探针0.5 w l总量15区l混匀室温静置20 分钟或以上。其中 :探针用量:这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.蛋白样品用量：一般用量在2-20ug(控制在1-5区蛋白,总体系15ul.细胞核抽屉物浓度都比较低 ,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.poly(dI:dC)(dI:dC):它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC),如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液：每 2-3ug 核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。未标记的竞争性寡核做为竞争的探真来说,其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的50-100 倍 .再这里我引申的解释一下其他的对照的含义:.常规反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针）；阴性对照反应（核蛋白+标记探针）；阳性对照（核蛋白+标记探针）探针冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100 倍量的未标记探针）；突变探针的冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针 100 倍量的未标记突变探针）； Super-shift反应（含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗体）.4 .预电泳和电泳：0.25X TBEB冰上120V预电泳1小时;务必换掉预电泳的缓冲液 用新的0.25X TB低温下150V,电泳约60分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化 ,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!5 .电转运在0.5X TB巾390mA电转移40分钟，注意转运膜的选择，有一种离 子加强型的转运效果比较好!我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!6 .紫外交联:正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm 处交联 10 分钟就可以了! 这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!条件比较成熟!可以借鉴!7 .化学发光反应包括 Blocking Buffer 30分钟封闭，Streptavidin-HRPfe记，Washing Buffer洗涤;Equilibration Solution 平衡 ,这些按照规定操作即可!没有太多的细节,只是注意两点，一是期间结合膜的表面一定不能干燥！!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上，而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴.8 .化学发光图像显示两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和Western 试验操作相当,只是这个膜是一次性的,不能重复使用,一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块的而不像WB 那样很规整的一条细线,这个很正常!希望大家交流讨论!
