考马斯亮蓝法——完整版PPT优秀课件.ppt

1,Tianjin Medical University,天津医科大学药学院体内药物分析第三章,考马斯亮蓝法（Bradford法）,徐 亮,2,一、基本原理,酸性溶液两者结合，使染料溶液的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。,3,二、试剂与器材 试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器,4,三、操作方法,1、标准曲线的制作,以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。,5,2、样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。,6,四、Bradford法的优缺点,1、优点,（1）灵敏度高：蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。,（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。,（3）干扰物质少。,7,2、缺点,四、Bradford法的优缺点,（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时最好选用 球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。,（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH,（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。,8,五、注意事项,1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的520min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。,9,六、思考题,说出你所知道的几种蛋白质定量测定的方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点？,10,五种蛋白质测定方法比较如下：,