《基因工程中的酶》演示PPT.ppt
1单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式l第三节基因工程中的酶学关键词：关键词：了解各种酶在基因工程中的作用掌握限制性内切酶和连接酶的基本特性逆转录酶在基因工程中参与了哪些反应？2重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶I反转录 酶多聚核苷酸激酶末端转移酶碱性磷酸酶识别 特异序列，切割DNA催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键 ，是DNA切口封合或是DNA片段连接合成双链cDNA的第二条链缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端合成cDNA代替DNA聚合酶I进行填补，标记 或DNA序列分析催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记 探针在3羟基末端进行同质多聚物加尾切除末端磷酸基3第一 限制性核酸内切酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。4一、限制性内切酶概念的提出寄主控制的限制（restriction）与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。5 为什么生物体产生的限制酶，不会损失自身的DNA呢？6R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶7 E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 以(k)噬菌体侵染E.coliB为例8限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）9细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基1011 R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解12切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 13I 型限制性内切酶 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。二、限制性内切酶的类型II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 基因工程的工具酶 切割位点不在识别位点，一般离识别位点25bp27bp，对分子克隆操作亦无实用意义 14首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 II类限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 15（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。识别位点处。16EcoR V 5-EcoR V 5-GATGATATCATC-3 -3 3- 3-CTACTATAGTAG-5 -5 产生平齐末端产生平齐末端（3）平末端（ blunt end ） 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。17l两条链上的断裂位置是交错地，但又是围绕着一个对称结构中心，这样形成的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）18含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 3-5-19CTGCAG 3端凸出（如Pst I切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 5-3-20与DNA结合的限制性内切酶BamH 1的结构。限制性内切酶识别双链DNA序列5-GGATCC-3，并在两个GG残基之间切开磷酸二酯键。这个切割形成带有两个有5粘性末端的DNA片段。这种蛋白质是有相同的亚基组成的二聚体。21 连接便利 （5）粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。2223 补平成平齐末端 5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。24l同位酶是具有相同的识别序列，但酶切位点不同的酶 如Sma I和Xma I的识别序列为 5-CCCGGG-3,但酶切位点不同。 Sma I 5-CCCGGG-3, Xma I 5-CCCGGG-3,同位酶25同裂酶（Isoschizomers）l有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端 lExample: 限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶 (CCGG) ，5 C .CGG 3 3 GGC .C 3 26同尾酶（Isocaudamer）l这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的BamH G GATC C Bcl T GATC A C CTAG G A CTAG T 27从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二 DNA 连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口。基因的“针线” 28DNA连接酶 在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在两条DNA链之间形成的磷酸二酯键 29（1）大肠杆菌连接酶1. 两种DNA连接酶只能连接粘性末端。二、DNA ligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。30（1）必须是两条双链DNA或DNA-RNA。（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+2. 连接条件313.DNA连接酶的基本性质32DNA连接酶的基本性质33连接酶反应的最佳温度是37C。三、连接反应的温度1. 最佳温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。2. 实用温度所以一般采用 416 C。34第三 DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶35二、DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质一条单链多肽。5533外切酶活性位于外切酶活性位于NN端。端。 3535的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 5353的的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性36大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途53的DNA聚合酶活性372. Klenow fragment2. Klenow fragment用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶 I可以切掉N端的5533外切酶活性外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性质38 3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。（2）主要用途3339 DNA 3 DNA 3末端标末端标记记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。403. 逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。来源RNA肿瘤病毒。41逆转录酶的用途以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。4243第四、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。44l其用途是： 除去 DNA 片段的 5 - 磷酸，以防止自身环化。 45第五第五、T4多核苷酸激酶1. 来源从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。2. 功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。不论5-OH端突出与否。46l该酶的用途是： 为化学测序法标记 DNA 的 5 末端；47小结1.限制性内切酶：切割2.DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。3.DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起作用。4849
