《谷氨酰胺转氨酶》.ppt

1,谷氨酰胺转氨酶,南京工业大学2011级食品科学汪开银,2,目录,第一、介绍第二、分离与纯化第三、理化性质的研究第四、应用前景,3,第一、介绍,谷氨酰胺转氨酶( Transglutaminase，EC2 3 213，简称TGase) 是一种催化酰基转移反应的转移酶。它具有多种催化功能，能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而直接改变蛋白质本身及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构和功能特性。 因此，TGase 在食品、生物医药、组织工程、纺织和皮革工业中都有着广泛的应用前景。,4,第二、分离与纯化,1.1 主要仪器和试剂J2-MC 微控高速冷冻离心机；ImageMaster VDS 胶成像分析系统；冷冻干燥机。N-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-单羟肟酸、还原型谷胱甘肽、羟胺。香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇等。,5,1.2 谷氨酰胺转氨酶活测定方法,Grossowicz 比色法测定酶活力， 以N-CBZ-Gln-Gly 和羟胺为作用底物， 以L-谷氨酸-单羟肟酸作标准曲线。一个谷氨酰胺转氨酶活力单位定义为：37 时每分钟催化形成1 mol L-谷氨酸-单羟肟酸的酶量为一个酶单位。 从标准曲线求出酶活： 酶活力/（U /mL）=7.983 5A525稀释倍数/10,6,1.3 提取,经过初步试验，确定食用菌中的谷氨酰胺转氨酶是一种胞外酶。从新鲜香菇子实体中提取谷氨酰胺转氨酶粗酶的工艺流程为：,7,分别测定香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇的谷氨酰胺转氨酶粗提液的谷氨酰胺转氨酶酶活性，结果分别为0.261、0.116、0.115、0.276 U/mL。可见不同菌种的谷氨酰胺转氨酶酶活性有较大的差异，香菇和杏鲍菇的谷氨酰胺转氨酶酶活性较强，平菇、金针菇的谷氨酰胺转氨酶的酶活性较弱，从它们的比活性来看，杏鲍菇最高，但市场上杏鲍菇的价格远远比香菇贵，且香菇容易获得，所以选用香菇作为以后的试验材料。,8,超滤方法 采用WB-3 型的中空纤维膜， 截留分子量为30 000 u，在加冰冷却的条件下，保持泵出水压为0.4MPa，对粗酶滤液进行超滤循环，直到达到相应的浓缩倍数，收集浓缩液。,9,乙醇沉淀 取粗提取液100 mL，按V（提取液）V（乙醇）=11；V（提取液）V （乙醇）=11.5；V（提取液）V（乙醇）=12体积分数比分别加入经预冷至0 的95 乙醇，迅速搅拌，将混和液离心（3 ，10 000 r/min，10 min），所得沉淀用0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH6.0）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容于100 mL，测定酶活，计算酶活收率。 （酶活收率分别为40 、387 、408 ）丙酮沉淀法 实验方法与乙醇相同。（酶活收率为59.2 ）,10,饱和硫酸铵沉淀 室温下， 加不同量的硫酸铵到100 mL 经超滤后的提取液（预冷至0）中，形成浓度为20、40、60、80的硫酸铵溶液，保持6 h 后，离心（10 000 r/min、3、5 min）， 将所得沉淀用0.2 mol/L Tris -HCl 缓冲液（pH6.0）溶解，再次以相同的条件离心，取上清液定容于100mL，测定酶活，计算酶活收率。（在60%时酶活最高，达到56.9%）,11,不同沉淀法对酶收率的影响 分别采用60 %饱和硫酸铵沉淀、95 %乙醇与丙酮沉淀法对粗酶进行沉淀分离，3 种沉淀法的酶活收率分别为569 %、436 %、59.2 %。 结果表明用丙酮和饱和硫酸铵沉淀的酶活收率要比乙醇沉淀酶活收率稍高一些。但是饱和硫酸铵沉淀法在酶液中引入了水溶性无机盐， 需要进行脱盐等步骤，较繁琐。有机溶剂沉淀法则不需脱盐及多次分离等步骤，过程短，且其为挥发性液体，在干燥中可挥发成气体而不残留， 或仅留其痕迹。而考虑到作为食品用酶，最好不用丙酮沉淀法，所以最终采用乙醇沉淀。,12,第三、理化性质的研究,3.1 粗酶的最适温度 冷冻干燥后的粗酶制成酶液分别在20、30、40、50、60 下测定酶活，以最高点酶活为100 %。3.2 温度对粗酶稳定性的影响 冷冻干燥后的粗酶制成酶液， 分别在20、30、40、50、60 的水浴中保留10 min，用冰浴快速冷却，然后在37下测定酶活，以未经处理的酶液酶活为100%。3.3 pH 对粗酶稳定性的影响 分别将酶液pH 值调节至（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）， 于4 放置12 h， 取出调节各样品的pH 至6.0，37 测定各样品酶活， 以未经处理的酶液酶活为100 %。计算相对酶活，得出曲线。3.4 粗酶的最适pH 将酶液的pH 值调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 测定酶活， 以最高点相对酶活为100 %，作出曲线。,13,3.5 金属离子对酶活的影响 在酶反应体系中分别加入相同浓度（1 mg/L）的各种金属离子（Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cu2+），37 保温10 min测定谷氨酰胺转氨酶粗酶酶活。以不加任何金属离子的酶活为参照。3.6 底物浓度对反应速度影响 分别加入底物（0.03 mol/L） 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，每支试管各加入0.2 mL 浓缩酶液，37 反应10 min，各管加0.2 mol/L Tris-HCl 缓冲液至1.6 mL，分别测定酶活性，求出反应速率，采用Lineweaver-Burk 双倒数法求得米氏常数Km 和最大反应速率Vmax。3.7 纯酶的最适温度 取浓缩酶液，分别在20、30、40、50、60 下测定酶活，以最高点酶活为100 %。,14,由图2 可见，香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶的最适温度在40 左右， 在30 50 范围内有较高活性，当温度大于50 后活性急剧下降。,15,从图3 可见，香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶在50 以下保持其稳定性，高于50 时酶的稳定性变差，活性丧失较快。这是因为酶在稳定升高到一定限度时，就会发生高级结构的变化失去部分催化活性， 酶发生的肽链伸展随稳定不同而有不同的伸展速度，温度越高，肽链伸展加深，直至变性，完全失去活性。,16,由图4 可见，香菇谷氨酰胺转氨酶的最适反应pH为6.0。,17,从图5 可看出，粗酶在pH5.07.0 左右稳定性最好。,18,结果如表2 所示，离子强度对酶活的影响不大,19,由图6 可知，在一定浓度范围内，随着底物浓度的增加，酶促反应速度显著加快， 当底物浓度大于2.5 g/L时反应速度不再显著增加，酶促反应速率接近Vmax。 做Lineweaver-Burk 图（图7），根据测定结果得到米氏方程1/V=74.5931/S+49.07，Vmax=0.020 g/（Lmin），米氏常数Km=1.520 g/L。,20,从图8 可以看出， 纯酶的相对酶活温度曲线与粗酶大致相同，最适温度也在40 左右，但在30 50 的范围内都具有较高的酶活性。,21,3.8 结论 香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶和纯酶酶学性质研究结果显示：香菇谷氨酰胺转氨酶粗酶最适温度为40，温度稳定范围在50 以下，最适pH 6.0，pH 稳定范围为pH5.07.0。香菇谷氨酰胺转胺酶酶促反应的Vmax 为0.020 g/（Lmin），米氏常数Km 为1.520 g/L 。Na+、Ca2+、Pb2+、K+、Mg2+、Cu2+ 等离子对谷氨酰胺转氨酶粗酶酶活影响甚微，该酶为非Ca2+依赖性酶。,22,第四、应用前景,谷氨酰胺酶在食品、医药（研究癌细胞方面）、纺织（如改善羊毛制品性能）等方面都有广阔的应用前景，其中在食品行业应用最受关注。4.1 在肉制品中的应用 肌球蛋白和肌动蛋白是肌肉的重要组成成分，是谷氨酰胺转胺酶作用的良好底物。在肉制品加热时，彼此间能够形成二硫键，对维持肉制品的保水性和粘弹性等方面起着重要的作用。在肉制品中加入谷氨酰胺转胺酶，经催化反应在肌肉蛋白质分子间形成的共价键的作用力远远大于二硫键，能使蛋白质更紧密地结合在一起，形成致密的三维网状结构，显著提高了产品的质构、改善了肉制品品质、增加了产品的附加价值。4.2 在乳制品中的应用 乳制品中的酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺转胺酶作用的良好底物，所以谷氨酰胺转胺酶在乳制品加工中具有很高的应用价值。牛乳酪蛋白是重要的食品蛋白质，在许多食品的加工中，加入酪蛋白可以改善产品的品质9。经过谷氨酰胺转胺酶改性后的酪蛋白，在功能性质方面得到显著增强，是优良的食品添加剂，可应用于焙烤食品、冰淇淋，也可作为脂肪的替代物，用于香肠、重组肉制品、鱼制品。,23,4.3 在水产品中的应用 鱼肉在低温下可形成凝胶，这与其内源性谷氨酰胺转胺酶的含量有关。新鲜的鱼含有较多的谷氨酰胺转胺酶，可以生产出高品质的鱼凝胶制品，但经过冷冻贮藏后的鱼，其内源性谷氨酰胺转胺酶的含量随新鲜程度的下降而减少，因此可以通过加入谷氨酰胺转胺酶提高一些产品的凝胶强度，加工出品质优良的产品。4.4 在小麦及大豆制品中的应用 经谷氨酰胺转胺酶作用后的面团在筋力、稳定性及粘弹性方面都有较大的改善，加工面包时加入该酶，可以明显增大面包的体积，使其质地均匀，减少切片时碎屑的产生，并有效防止面包的老化，延长保质期。谷氨酰胺转胺酶可以减少方便面的吸油率，从而减少方便面的热量，同时减少油炸时油的消耗量。,24,Thank you!,