实验植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测.docx

植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测(2010级生态班实验方案)一、实验目的1 .明白得用CTAB法提取植物组织DNA的原理。2 .把握CTAB法提取植物组织DNA的方式。3 . 了解真核基因组DNA的有关特性。二、实验原理由于植物细胞含有细胞壁及其细胞内高含量的多糖物质，因此一样的提取 真核细胞基因组DA的方式用在植物细胞上并非十分有效。十六烷基三乙基滨 化铁(cetyltriethy 1 ammonium bromide, CTAB)法是经常使用的提取植物细 胞基因组DA的方式。CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复 合物，在高盐溶液中(L NaCl)时，CTAB-核酸复合物是可溶的，当降低溶液 盐浓度到必然程度(L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸 复合物与蛋白质、多糖类物质分开。CTAB-核酸复合物再用70 75%酒精浸泡可 洗脱掉CTABo再通过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯 化DA ,最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。植物DA的提取程序应包括以下几项：必需破碎或消化细胞壁释放出细 胞内容物；必需破坏细胞膜及核膜，使DA释放到提取缓冲液中，经常使用 CTAB一类的去污剂使细胞膜崩解；DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、 多糖等杂质，可利用氯仿、RNase等除去。一旦DNA释放出来，其剪切破坏的 程度必需要降到最低。CTAB法提取植物DNA,方式比较简单，适用于大多数植 物。尽管取得的DNA纯度不是很高，但仍能知足限制性内切核酸酶分析或PCR 扩增的要求。三、实验材料、试剂和仪器1 .材料2 .新鲜的植物组织(如幼叶、花器、幼根)或-80冻存的材料。3 .仪器、用具:离心机、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、pH汁、高压灭菌锅、一次性手套、电泳 仪、电泳槽等。4 .试剂(1) 2 x CTAB 缓冲液：2%100 mmol/L20 mmol/Lmol/LCTAB(W/V)Tris-HCI pHEDTA pHNaClPVP (聚乙烯毗咯烷酮)1%(2) TE 缓冲液(pH:称取 1.211g Tris、0. 372 g EDTA-Na 二，先用 800 mL 蒸饰水加热搅拌溶解，用盐酸调pH ,再用蒸储水定容至1000 mLo 高压灭菌20 mino(3) 氯仿/异戊醇(24:1, v/v):将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4保留。(4) 尸-藻基乙醇(5) 70%乙醇(6) 乙醇或异丙醇(7) 5XTBE电泳缓冲液(1L)：Tris54gNazEDTA 2H：03. 72g硼酸临用前稀释至X TBE电泳缓冲液(8) 6X上样缓冲液：新臭酚兰、40与蔗糖(9)四、实验步骤(一)植物DNA提取1 .在51nL离心管中，加入1000 口1的2XCTAB, 65c预热。用前加入20 ul P- 部基乙醇。2 .取嫩的组织材料g,放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用 干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，充分混匀后置65c水浴中保 温45-60min,并非时轻轻转动试管。3 .加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地倒置混匀，室温下10 OOOrpm离心10 min, 移上清至另一 5 ml新管中。4 .吸上清到新管中（5mL离心管），用氯仿/异戊醇重复抽提一次。5 .加入2倍体积的100%乙醇或倍体积异丙醇，会显现絮状沉淀,-20放置30 min 或-80c放置 lOmin, 12 OOOrpm 离心 10-15min 回收 DNA 沉淀。6 .弃上清，用70%乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2或TE缓冲 液中。7 .用紫外分光光度计在260 nm、280 nm波长别离读数。其中260 nm读数用来 估量样品中DXA的浓度，0D3/（0。的值用于估量DNA的纯度。1个0D的值相当于 50 u g/ml 双链 DNAo样品浓度（u g/ml）=0供8 x稀释倍数x 50关于 DNA 纯制品，其 0D涉/0Ds=。OD/o/OD：g>说明有 RNA 污染；0D：60/0D：30< 说明有蛋白质污染。注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速 冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割超级重要，不能振荡，不能利用太 细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物 DNA抽提中的要紧污染物，提取材料要尽可能利用幼嫩叶片。若是试材较老、多 糖含量高，在提取缓冲液中应提高B-筑基乙隙的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提 之前先用酚：氯仿:异戊醇抽提一遍，如此去除蛋白较为完全。所得DA应为无色或灰白色，假设呈褐色那么有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液 中CTAB的浓度可增至3%或更高。（二）琼脂糖电泳检测DNA制作%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液10 UL+4UL上样缓冲液，电 泳检测。用入DNA做分子量大小的Marker,若是带型不弥散，在与Marker 20 kb的带的相应位置显现整齐敞亮的条带，说明DNA完整，没有降解。（1）制胶槽水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与制胶槽之间留1mm空 间。（2）称取DA电泳用琼脂糖0.4g放入250nli的三角烧杯中，加入50nli XTBE 缓冲液，混匀后，将烧瓶放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解（每 块胶用20 ml左右融化的%的琼脂糖凝胶，每两组配50ml %的琼脂糖凝 胶）。（3）掏出三角烧瓶，将其置室温下冷却至60C左右（手握烧瓶能够耐受）， 即将凝胶溶液倒入制胶槽中。（4）室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳 槽中。（5）在电泳槽中加入XTBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。（6）取一 PE手套（用PE手套混合样品和上样混合液，样品整体积不宜超过 15 UL）,如下表所示预备电泳样品，用移液器混匀。序号1234样品ADNA/HindHlDXA溶液DNA溶液DNA溶液体积5 HL58106X上样缓冲 液2pL2 uL3uL4 HL（7）用加样器吸取样品。依次别离加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置 于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要避免将样品溢出孔外。（8）接通电源，调剂电压至80伏，电泳直至浪酚蓝指示剂距胶底1cm处,将凝胶板掏出，用凝胶成像系统成像或在紫外灯下观看结果，拍照。