DB33T532005动物尿样中莱克多巴胺的测定.docx
DB33 T 536-2005动物尿样中莱克多巴胺的测定-A-/ A刖本标准由浙江省农业厅提出并归口.浙江一星集团饲料本标准由浙江省畜产品质量平安检测中央、浙江省疾病预防限制中央负责起草,有限责任公司参与起草.动物尿样中莱克多巴胺的测定1范围本标准规定了以酶联免疫ELISA 法、高效液相色谱HPLC法和气相色谱质谱GC-MS 法检测动物尿样中莱克多巴胺的方法,规定GC-MS法为仲裁法.本标准适用于动物尿样中莱克多巴胺的测定.酶联免疫ELISA法为筛选方法,检测限为 5g/L,高效液相色谱HPLC 法和气相色谱质 谱GC MS法为定量方法,定量限HPLC法为5科g/L、GCMS法为1科g/L.线性范围：酶联免疫ELISA 法为0.005ng-0.05ng ,高效液相色谱 HPLC法为2.5ng-10ng ,气相色谱质谱GC- MS法为0.05ng-1.0ng .2标准性引用文件以下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.但凡注日期的引用文件,其随后所有的修改单不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.但凡不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准.GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试样制备采集的尿样应保存于 4c左右的冰箱中.尿样如有混浊,应经离心处理.第一法酶联免疫法4原理与方法4.1 原理本方法是酶联免疫法中的竞争性测定法,其主要原理是：吸附在孔内的莱克多巴胺与标准或样品中的莱克多巴胺竞争性地与莱克多巴胺抗体相结合,与标准品或样品相结合的莱克多巴胺抗体被洗涤去除后,只剩下与微孔内药物相结合的抗体,其再与参加的酶标记的第二抗体相结合,酶底物在酶作用下产生蓝色产物,吸光度的上下与样品中莱克多巴胺的含量成反比.4.2 方法采用莱克多巴胺酶联免疫试剂盒或类似产品,按试剂盒说明书操作.5试剂和溶液5.1 除非另有说明,本法所用试剂均为分析纯,水为去离子水,符合GB/T 6682二级水的规定.5.2 PBS缓冲液：用水10倍稀释厂商提供的浓缩 PBS缓冲液.5.3 工作洗液：用水20倍稀释厂商提供的浓缩洗液.5.4 第二抗体工作液：用第二抗体稀释液2500倍稀释第二抗体.6仪器与设备6.1 微孔板酶标仪带450nm滤光片.6.2 振荡器.6.3 冷冻离心机.6.4 微量加样器及配套吸头：20 l L, 50 l L, 100 l L, 200 dL .6.5 冰箱.6.6 洗板机.6.7 生化培养箱.6.8 分析天平：感量 0.01g.7测定步骤7.1 考前须知不同品牌的试剂盒其操作步骤可能略有差异,具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整.7.2 样品处理把试样于4000rpm的转速离心10min,取上清液用PB强冲?夜5.1 稀释十倍后直接参加微孔进行 ELISA测定.7.3 测试程序7.3.1.1 根据所测定样品及标准数,计算出所需微孔条数,将微孔条插入微孔架,标准和样品做两个孔的平行重复,记录标准和样品的位置.7.3.1.2 参加50 dL的标准品和处理好的样品到各自的微孔中,标准和样品做两个平行重复.7.3.1.3 参加100dL第一抗体溶液到每一个微孔中,在 37c孵育30分钟后倒出孔中的液体,将微孔 架倒置在洗水纸上拍打每轮拍打3次以保证完全除去孔中的液体,再参加工作洗液5.2 250 L,重复操作两遍.最后用吸水纸吸干.7.3.1.4 力口入150 dL稀释的酶标记的第二抗体 5.337C孵育30分钟后倒出孔中的液体, 将微孔架 倒置在洗水纸上拍打每轮拍打 3次以保证完全除去孔中的液体,再参加工作洗液5.2 250 L,重复操作两遍.最后用吸水纸吸干.7.3.1.5 参加100科L酶底物液到微孔中,充分混合并在室温孵育5-10min.7.3.1.6 参加50 dL反响终止液到微孔中,混合后在450nm处测量吸光度值.8结果计算以空白浓度为0的标准溶液吸光度值为 100%计算,折算出各标准和样品的相对吸光度值.标准的吸光度值或样品相对吸光度值 = X100空白的吸光度值计算出的标准相对吸光度值绘成为一个对应浓度ng/L的半对数坐标系统曲线图,校正曲线在200-2000ng/L范围内应当成为线性.相对应每一个样品的浓度ng/L可以从校正曲线上读出.第二法高效液相色谱法9方法原理用叔丁基甲醛为提取剂提取动物尿样中的莱克多巴胺,经固相萃取柱净化,浓缩后用2%乙酸溶液定容,用高效液相色谱-荧光检测法别离测定.10试剂和溶液10.1 除非另有说明,本法所用试剂均为分析纯,水为去离子水,符合 GB/T 6682二级水的规定.10.2 乙睛：色谱纯.10.3 甲醇.10.4 冰醋酸.10.5 乙酸乙酯.10.6 叔丁基甲醛.10.7 无水硫酸钠.10.8 戊烷磺酸钠：色谱级.10.9 氢氧化钠.10.10 氯化钠.10.11 1mol/L NaOH溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液 56mL,力口水至1000mL ,摇匀.10.12 2%乙酸溶液：5mL冰醋酸加水至 250mL,混匀.10.13 3%甲醇/乙酸乙酯溶液：取 15mL甲醇加乙酸乙酯至 500mL ,混匀.10.14 50 %甲醇/乙酸乙酯溶液：取 250mL甲醇力口乙酸乙酯至 500mL,混匀.10.15 戊烷磺酸钠溶液：取800mL水,加20mL冰醋酸和0.87g戊烷磺酸钠10.7, C5H11O3SNa?H2O, 混匀.10.16 固相萃取柱1:每根柱填料量为 500mg ,柱体积5mL.10.17 莱克多巴胺标准溶液：莱克多巴胺贮备液250 g/mL:精密称取莱克多巴胺对照品 25mg,置100ml容量瓶中,用甲醇10.2溶解并定容至刻度,其浓度为250g/ml,置-20 C冰箱中,可保存 3个月.莱克多巴胺稀释液5 d g/ml :精密量取1ml莱克多巴胺贮备液10.16.1,置50mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,为 莱克多巴胺工作液.莱克多巴胺工作溶液：分别准确吸取一定量的标准稀释液10.16.2 ,用2%乙酸溶液10.11 稀释、定容,配制成浓度为 0.05g/mL、0.1 科 g/mL、0.2 科 g/mL、0.5 科 g/mL、1.0 科 g/mL、2.0 科 g/mL的标准溶液.11仪器设备11.1 高效液相色谱仪配荧光检测器.11.2 冷冻离心机.11.3 振荡器.11.4 分液漏斗100mL.11.5 微孔滤膜0.45 pm.11.6 涡旋混合器.11.7 分析天平 精度0.0001g.11.8 旋转蒸发仪.11.9 鸡心瓶 50mL.11.10 离心管 50mL, 10mL.11.11 氮吹仪.12测定步骤12.1 试样提取取试样10.0mL至50mL离心管中,用1mol/LNaOH溶液调节pH值为10,加1g氯化钠10.9,振摇 数秒,力口 10mL叔丁基甲醛10.5提取,涡旋1min ,中速振荡10min, 7000rpm离心5min ,取上清液经 无水硫酸钠10.6过滤,收集于50mL鸡心瓶中；另取10mL叔丁基甲醛重复提取一次.用 2mL叔丁基 甲醛洗涤无水硫酸钠,旋转蒸干.1固相萃取柱的填充料为硅藻土和硅胶.12.2 试样净化用2mL乙酸乙酯10.4溶解鸡心瓶中的剩余物,过固相萃取柱10.15,先经5mL甲醇和5mL乙酸乙酯润洗；另取3mL 3%甲醇/乙酸乙酯10.12洗涤鸡心瓶的剩余物一次,过柱；再用 5mL 50%甲 酉享/乙酸乙酯10.13洗脱,氮吹至干.12.3 定容用2%乙酸溶液10.11定容到1mL,过膜,上机.12.4 测定12.4.1 高效液相色谱条件色谱柱：C18柱,长250mm ,内径4.6mm,粒度5科m ,或相当者.保护柱：C18柱,长20mm,内径3.9mm ,粒径5im,或相当者.流动相：戊烷磺酸钠溶液10.15:乙睛10.1 = 80: 20,使用前脱气.流速：1.0mL/min.激发波长：226nm.发射波长：306nm.进样量：50L.12.4.2 上机测定取相应浓度的标准工作液和样品制备液,分别注入液相色谱仪, 作单点或多点校准,以色谱峰面积按外标法积分定量.13结果计算与表达试样中莱克多巴胺的含量按下式计算：1000 x Ai x Csx VsX =Asx Vi 式中：X 样品中莱克多巴胺的含量g/LAi样品峰面积As对照溶液峰面积Cs对照溶7«浓度g/ mLVi样品体积mLVs定容体积mL测定结果用平行测定的算术平均值表示,保存2位有效数字.14精密度14.1 重复性实验室内平行测定间的相对偏差不大于10%.14.2 再现性实验室间测定的相对偏差不大于15%.第三法气相色谱-质谱法用叔丁基甲醛为提取剂提取动物尿样中游离的莱克多巴胺,然后用固相萃取柱净化,BSTFA 双三甲基硅基三氟乙酰胺+TMCS 三甲基氯硅烷衍生,最后用GC/MS法进行定性定量分析.16仪器与试剂16.1 气-质联用仪.16.2 烘箱.16.3 BSTFA 双三甲基硅基三氟乙酰胺+1%TMCS 三甲基氯硅烷.16.4 莱克多巴胺标准贮备溶液5mg/mL:准确称取 50mg莱克多巴胺于10 mL容量瓶中,用甲醇 溶解并定容至刻度,存放在冰箱中备用.16.5 莱克多巴胺标准工作溶液：取莱克多巴胺标准贮备溶液,用甲醇稀释至所需浓度.16.6 甲苯.16.7 其它仪器,同11.16.8 其它试剂,同10.17测定步骤17.1 试样提取同 HPLC 法 12.1.17.2 试样净化同 HPLC 法 12.2.17.3 试样衍生蒸发剩余物加0.1 mL BSTFA+1%TMCS 16.3,加盖瓶于旋涡混合器上震荡,在 80c的烘箱 中加热1.0 h,氮气吹干,力口 0.2mL甲苯16.5溶解.取适量的莱克多巴胺标准工作溶液,氮气吹干,与试样同法进行衍生化.17.4 色谱条件色谱柱：5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱30 mX0.25 mmX0.25m,或相当者.进样口温度：300 C o柱温程序：初温150C,保持3 min,然后以10C/min升至230C ,保持10min ,再以20C/min 升至280c保持10min.载气：高纯氨气99.999%.流速：1.0mL/min ,不分流进样.进样量：1.0八17.5 质谱条件EI源：源温230C.电子能量：70eV.接口温度：280C.电子倍增器电压：1506V o质量扫描范围：30550U.选择离子监测方式SIM .监测离子m/z : 267、250、179、502.溶剂延迟：5 min.17.6 上机测定莱克多巴胺对照溶液和试液分别注入气相色谱-质谱联用仪,记录谱图,按外标法以峰面积进行计算.结果按下式计算：X=m i x n/m式中：X 样品中莱克多巴胺含量ng/gmi质谱测定对应莱克多巴胺量ngm取1量gn稀释倍数3位有效数字.测定结果用平行测定的算术平均值表示,保存19精密度19.1 重复性实验室内平行测定间的相对偏差不大于10%.19.2 再现性实验室间测定的相对偏差不大于15%.
