黑木耳黑色素体外抗氧化性能力测定.doc
9-12月份，实验计划9-11月中旬，黑木耳黑色素体外抗氧化性能力测定11月下旬至1月，数据处理及论文写作黑木耳黑色素的体外抗氧化活性 FC 3.146 LWT 2.114 农业工程学报真菌黑色素研究进展微生物学通报预实验：黑木耳黑色素体外抗氧化性能力测定1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验样品黑木耳黑色素（自己提纯）（无标记 HPLC检测纯度>99%）1.1.2主要试剂1.1.3主要仪器超微弱化学发光测量仪可见分光光度计1.2 样品溶液的准备精密称取4.6mg melanin，70%乙醇定容至10mL，配成浓度为10-3mol/L的溶液。分别吸取0.1mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL依次定容至10mL，配成1×10-5mol/L、5×10-5mol/L、10×10-5mol/L、15×10-5mol/L、20×10-5mol/L和25×10-5mol/L的溶液。1.3 试剂的配制（1）0.2mol/L的PBS（pH6.6）（2）0.3%的K3Fe(CN)6（3）10%三氯乙酸（4）0.05mol/L的鲁米诺：用0.05mol/L的NaOH溶液配制，在避光处保存，临用前用双蒸水稀释成1mmol/L的溶液。（5）0.01mol/L的邻苯三酚：用1mmol/L的HCl溶液配制，4冰箱中保存，用前用双蒸水稀释成6.25×10-4mol/L的溶液。（6）0.05mol/L的pH10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液：含0.1mmol/L的EDTA，用前现配。（7）鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液a：将（6）与（4）按体积比2：1混合而成。（8）1mmol/L的CuSO4溶液（9）1mmol/L的邻菲啰啉溶液（10）0.05mol/L的硼砂溶液（11）1mmol/L的Vc溶液（12）0.15%的H2O2溶液（13）0.15mol/L H2O2（14）鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液b:0.1mmol/L的鲁米诺与pH9.5的0.05mol/L碳酸盐缓冲溶液（V/V,1:17）配制而成。1.4实验方法1.4.1还原力的测定取1mL的样品溶液+0.2mL的0.2mol/L的PBS（pH6.6）+1.5mL0.3%K3Fe(CN)6于试管中混匀，50水浴反应20min,流水速冷，加入1mL10%三氯乙酸混匀，以3000r/min离心10min，取2mL上清液，加0.5mL0.3%FeCl3混匀，再加3mL蒸馏水摇匀，以蒸馏水调零，测定A700，A700越大，表示还原能力越强。用蒸馏水作为无还原能力对照，Vc作为有还原能力对照。1.4.2清除超氧阴离子能力的测定采用邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系测定清除超氧阴离子能力：测定时，向发光池中注入10.0L不同浓度的样品（以样品缓冲溶液为对照）然后注入6.25×10-4mol/L的邻苯三酚0.05mL，最后加入鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液0.94mL启动反应（30），间隔2s记数发光强度，测定300s内化学发光动力学曲线，至出现峰值，用蒸馏水做空白对照组，本底发光强度为未加邻苯三酚时的发光值。平行测定三次，取平均值，计算抑制率。抑制率=(Cl1-Cl2)(Cl2-Cl0)/ (Cl1-Cl0)×100%式中Cl1为空白对照组的相对发光强度，Cl0为本底组相对发光强度，Cl2为样品组相对发光强度。1.4.3清除羟基自由基能力的测定采用邻菲啰啉化学发光体系（CuSO4-邻菲啰啉-Vc-H2O2）测定样品溶液对·OH的清除作用。加入不同浓度的样品溶液50L在样品池中，分别依次加1mmol/L的CuSO4溶液50L，1mmol/L的邻菲啰啉溶液50L及0.05mol/L的硼砂溶液700L（pH=9.0）充分混合，快速加入100L1mmol/LVc和50L0.15%H2O2溶液，立即启动化学发光系统，间隔3s计数，记录400s内化学发光动力学曲线，至出现峰值，用蒸馏水做空白对照组，本底发光强度为未加H2O2时的发光值。平行测定三次，取平均值，计算羟基自由基清除率（%）的方法同1.4.2。1.4.4清除H2O2能力的测定采用H2O2-鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液（pH=9.5）体系检测H2O2。取各浓度的待测样品50L于样品池中，加入50L0.15mol/L H2O2和900L鲁米诺-碳酸盐缓冲溶液b，反应总体积为1mL，启动发光系统，间隔2s记数，至出现峰值，记录180s内化学发光动力学曲线。平行测定三次，取平均值，计算H2O2清除率（%）的方法同1.4.2。1.4.5抗脂质过氧化活性的测定硫氰酸铵比色法。以其对亚油酸过氧化抑制率表示其抗脂质过氧化活性。准确称取0.2840 g亚油酸、0.2804 g吐温-20，再加入10 mL pH7.0的磷酸盐缓冲液（以0.025 mol/L磷酸二氢钾和0.025mol/L的磷酸氢二钠配制）定容至50 mL，得到亚油酸乳液。准确称取0.5 mg待测样品，溶解于0.5 mL的蒸馏水中，再与2.5 mL亚油酸乳液混合均匀后，置于37恒温箱中保温45h，得培养液。取培养液0.1 mL，按顺序加入4.7 mL 75%乙醇、0.1 mL 30%硫氰酸铵、0.1 mL氯化亚铁（0.02 mol/L，用3.5%盐酸配制），混合均匀后，室温下静置3 min，在波长510 nm下测吸光值。每个样品重复3次，对照以亚油酸代替样品。按下式计算对亚油酸过氧化抑制率。IlP=1（A1/A0）× 100% （4）式中IlP 对亚油酸过氧化的抑制率，%；A1 加入样品后的吸光度；A0 对照吸光度。Mitsuda H, Yasumoto K, Iwami K. Antioxidative action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acidJ. Eiyo to Shokuryo，1966，19：2102142 实验方案2.1还原力的测定实验编号样品浓度吸光度吸光度平行对照（Vc）11×10-5mol/L25×10-5mol/L310×10-5mol/L415×10-5mol/L520×10-5mol/L625×10-5mol/L2.2 清除超氧阴离子能力的测定 实验编号样品浓度超氧阴离子清除率超氧阴离子清除率平行11×10-5mol/L25×10-5mol/L310×10-5mol/L415×10-5mol/L520×10-5mol/L625×10-5mol/L2.3清除羟基自由基能力的测定 实验编号样品浓度羟基自由基清除率羟基自由基清除率平行11×10-5mol/L25×10-5mol/L310×10-5mol/L415×10-5mol/L520×10-5mol/L625×10-5mol/L2.4清除H2O2能力的测定 实验编号样品浓度H2O2清除率H2O2清除率平行11×10-5mol/L25×10-5mol/L310×10-5mol/L415×10-5mol/L520×10-5mol/L625×10-5mol/L
