吡格列酮对内皮祖细胞增殖、凋亡及功能的影响..doc
吡格列酮对内皮祖细胞增殖、凋亡及功能的影响08-10-13 13:27:00 编辑：studa20作者：邸春霞，陆庆明，郭文怡，王海昌，张荣庆，殷忠【摘要】目的：观察不同浓度吡格列酮对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCS增殖、凋亡和功能的影响，并探讨其可能的作用机制.方法：正常SD大鼠24只，随机分为A组(对照组)和B,C,D组吡格列酮组剂量依次为10, 20, 40 mg/ (kg d)，灌胃处理10 d后断颈处死，密度梯度离心法获取骨髓单个核 细胞，经鉴定后证实为EPCs.每组细胞培养4 d后消化、计数并用完全培养液 培养.24 h后检测NO生成量，3 d后检测凋亡情况，7 d后检测增殖能力.结 果：与A组相比，B,C,D组EPCs增殖能力明显增高B, C, D组A490 nm分别 为(0.423 ± 0.004) ,(0.680 ± 0.008 ) , (0.443 ± 0.005) vs A 组 A490 nm(0.143 ± 0.006) , P<0.01 ;凋亡程度降低B, C, D组分别为(32.8 ± 0.8)% ,(30.9 ± 2.3)%, (33.0 ± 3.9 )% vs A 组(40.1 ± 1.1)%,P<0.01;培养上清中NO浓度显著提高B, C, D组分别为(29.2 ± 3.7),(41.0 ± 7.7),(28.7 ± 6.4) 卩 mol/L vs A 组(18.9 ± 1.4),P<0.05;与C组相比，B组和D组促进EPCs增殖能力弱(P<0.01)，培养上 清中NO浓度相对低(P<0.05).结论：不同浓度吡格列酮均能提高 EPCs数量 和功能；20 mg/ (kg d)吡格列酮对EPCs的作用较强.【关键词】吡格列酮；内皮祖细胞；糖尿病0引言血管内皮在心血管疾病发病机制中起重要作用，多种心血管疾病都伴有 内皮功能障碍.内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮的前体细胞，在特定应激条件下 可分泌促血管生长因子并参与内皮修复和新生血管形成(包括血管新生和血管 发生)1.研究2-3 发现，糖尿病患者的EPCs增殖能力减退，体外黏 附、形成毛细血管的能力也降低.吡格列酮是一种噻唑烷二酮类胰岛素增敏 剂，对2型糖尿病有较好的降糖效果和耐受性.研究4表明，吡格列酮可以 促进EPCs介导的新生血管形成，但具体作用机制不明.我们拟探讨体外培养条 件下，不同浓度吡格列酮预处理对正常大鼠的骨髓源性EPCs增殖、凋亡及功能的变化，为改善内皮损伤提供实验依据.1材料和方法1 . 1材料雄性SD大鼠24只，体质量7080 g (第四军医大学实验动 物中心)；M199培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国 Hyclon公 司)；血管内皮生长因子(VEGF美国Biovision公司)；碱性成纤维细胞生 长因子(bFGF英国Peprotech公司)；乙酰化低密度脂蛋白(DiI ac LDL,德国Invitrogen 公司)；胰岛素和荆豆凝集素I ( FITC UEA I，美 国 Sigma公司)；AC133和 CD34 (英国 eBioscienee 公司)；flk 1 (美国Chemicon公司）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）； NO检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；盐酸吡格列酮（成都宇洋高科技 发展有限责任公司）1 . 2方法1 . 2. 1实验分组及吡格列酮干预将大鼠随机分为 4组，每组6只，A 组（对照组）给予9 mL/L注射用生理盐水，B, C, D组分别给予盐酸吡格列酮 10, 20, 40 mg/ （kg d）.灌胃喂养 10 d.1 . 2. 2分离培养EPC颈椎脱臼法处死大鼠，剥去皮肤，取四肢置750mL/L乙醇5 min ;将骨两端软骨用无菌剪刀剪除，用 M199培养液冲洗骨髓腔； 将骨髓细胞悬液轻置于淋巴细胞分离液表面、离心并吸取乳白色单核细胞层， M199培养液洗涤后用含VEGF bFGF的完全培养液重悬、计数并接种到培养瓶 中，4 h后将培养瓶翻面.1 . 2. 3EPCs表型鉴定培养6 d的细胞用2.5 g/L 胰酶和0.2 g/L 乙二 胺四乙酸消化并接种于盖玻片.24 h后向细胞爬片孔内加入10 mg/L Dil ac LDL 100卩L并置37C孵育1 h，多聚甲醛室温固定10 min，PBS漂洗后加 入10 mg/L FITC UEA I 100卩L,避光孵育1 h，PBS洗涤、晾干后封 片，激光共聚焦显微镜观察.1 . 2. 4NO检测将培养4 d的细胞消化、计数后以1.5 X 104/孔接种于 96孔板培养.按NO试剂盒说明书，24 h后于每孔吸上清100卩L,采用硝酸 还原酶法特异性将各孔上清液中 NO3还原为NO2-,并测定NO2浓度，从而间 接反映NC含量.1 . 2. 5凋亡检测将培养4 d的细胞消化，不完全培养液（无血清）培养 24 h后加入含血清的完全培养液培养.3 d后再次消化贴壁细胞，以1000 r/min离心5 min后弃上清，行双标记流式细胞术检测.1 . 2. 6增殖能力检测分离EPCs并以1.5 X 104/孔接种96孔板.培养7 d后向每孔培养液中加入5 g/L MTT溶液20卩L,置孵育箱4 h后吸弃上 清，每孔加入二甲基亚砜150卩L,微量振荡器充分振荡10 min，用酶联免疫 检测仪测各孔A490 nm.统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对多组比较 采用单因素方差分析，多重均数差异显著性检验采用检验，P<0.05为差异有统计学意义.2结果2 . 1细胞形态观察显微镜下见培养 7d的细胞多呈梭形或多角形，且有集落样结构出现.培养7d的细胞经（红色荧光） 和.(绿色荧光)双染后，激光扫描共聚焦显微镜观察示双染阳性(桔黄色荧光)细胞为正在分化的 EPCs图1).阳性;出匚“ LB I阳性; U 冗L【)L和 双染.图1激光扫描共聚焦显微镜检测细胞表面标志免疫荧光双染法X 2002 . 2不同浓度吡格列酮对EPCs增殖能力的影响AD各组A值依次为：(0.143 ± 0.006),( 0.423 ± 0.004),( 0.680 ± 0.008 ),(0.443 ± 0.005).与A组相比，B, C, D组对EPCs增殖有明显的促进作用(P<0.01);与C组相比，B, D组促进EPCs增殖作用较弱(P<0.01).
