谷氨酰胺合成酶测定.doc

谷氨酰胺合成酶（GS活性测定一、实验原理谷氨酰胺合成酶（GS是植物体内氨同化的关键酶之一，在 ATP 和皿6+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中， 谷氨酰胺转化为 丫一谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形 成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度 计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的丫一谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位卩mol mg1proteinh l也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位 A - mg 1 protein h 1O二、实验仪器与用具 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（ 2ml、 1ml）三、实验试剂（1）提取缓冲液（0.05mol/L Tris-HCI , pH8.0）。 内含 2mmol/L Mg2+， 2mmol/L DTT， 0.4mol/L 蔗糖。称取 Tris （三羟甲基氨基甲烷） 1.5295g , 0.1245g MgSO- 7H2Q 0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和 34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用 0.05 mol/L HCl （0.1mol/L = 1ml 的 36%38浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0，最后定容至 250ml；（ 2）反应混合液 A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲， pH7.4）。内含80mmoI/L M（g+, 20mmoI/L 谷氨酸钠盐，20mmoI/L 半胱氨酸和 2mmoI/L EGTA 称取 3.0590g Tris , 4.9795 gMgSQ 7H2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA去离子水溶解后，用O.1mol/LHCI调至pH7.4,定容至250ml;(3) 反应混合液B (含盐酸羟胺，pH7.4)。反应混合液A的成分再加入80mmoI/L盐酸羟胺，pH7.4 ；(4) 显色剂( 0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和 0.6mol/L HCl 混 合液)。3.3176g TCA(三氯乙酸)，10.1021g FeCb 6H2O,去离子水溶解后，加 5ml 浓盐酸，定容至 100ml；(5) 40mmol/L ATP溶液。 称取0.1210g ATP溶于5ml去离子水中(临用前配制)四、方法步骤1. 粗酶液提取称取植物材料0.5-1g与于研钵中，加3ml (实际情况作调整)提取 缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4C下12,000r.min -1离心20min,上清液即为粗酶液。2. 反应1.6ml反应混合液B,加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37C下保温半小时，加入显色剂1ml,摇匀并放置片刻后， 于5,000 r.min -1下离心10min,取上清液测定540nm处的吸光值，以 加入1.6ml反应混合液A的为对照。3. 粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取1ml用考马斯亮蓝G-250测 定可溶性蛋白质 （方法待定， 试着不用定容直接测， 即取样品液 1ml， 如蛋白含量高，再适当稀释，加考马斯亮蓝 5ml,在595nm下测定吸 光值，注意应放置 10min 后在测，在 1h 内比色完）4. 结果计算GS 活力二A/（P.V.T）式中A 540nm处吸收值P- 粗酶液中可容性蛋白的质量浓度（ mg/mL）V- 反应体系中加入的粗酶液体积（ mL）T- 反应时间GS活力是以每毫克酶蛋白在每小时催化生成的丫一谷氨酰基异羟肟酸与铁络合的产物在540nm处的吸光值的大小来表示注意：在测酶时,由于各酶活力大小的表示都是以每小时 /min 产生 生成一定量的产物的量来表示,不同的时间长度产生产物的量不同, 所以在测量时, 要严格控制时间, 要保证测同一指标的各批次材料在 处理时间（反应时间）要严格一致！ ！