人教版选修一5.3血红蛋白的提取与分离(共43张PPT).pptx

5.3血红蛋白的提取与分离,1,不是所有牛奶都叫特仑苏,如何从混合物中提取、分离高纯度的蛋白质呢？,2,湖南郴州又现“大头娃娃”,一、基础知识,1、蛋白质提取与分离的依据,分子的形状和大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。,3,一、基础知识,琼脂糖凝胶,也称做分配色谱法,4,一、基础知识,2、凝胶色谱法,较短,较长,较快,较慢,先从凝胶柱洗脱出来,后从凝胶柱洗脱出来,凝胶外部,凝胶内部,5,一、基础知识,2、凝胶色谱法,6,一、基础知识,3、缓冲溶液洗脱液,问题1：什么是缓冲溶液？,在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。,问题2：缓冲溶液的作用是什么？,能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。,7,一、基础知识,3、缓冲溶液洗脱液,问题3：缓冲溶液如何配置？,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。,问题4：本实验选用的缓冲溶液是什么？,磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4),8,一、基础知识,4、电泳,9,一、基础知识,4、电泳,凝胶电泳原理示意图,10,一、基础知识,4、电泳,电泳类型：琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（可以加SDS）,11,一、基础知识,4、电泳,12,二、实验操作,1.样品处理： 洗涤红细胞 释放血红蛋白 分离血红蛋白,2.粗分离： 透析,3.凝胶色谱纯化： 按分子量大小分离其他蛋白,4.纯度测定： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度,13,二、实验操作,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,14,二、实验操作,血红蛋白（90%）,15,二、实验操作,低速,16,二、实验操作,洗涤红细胞,加蒸馏水至原血液体积,加入40%甲苯,磁力搅拌器充分搅拌,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,17,二、实验操作,分离过程,红细胞混合液,18,二、实验操作,有机溶剂 无色透明的甲苯层(第1层),脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层(第2层),血红蛋白溶液 红色透明液体(第3层),红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物(第4层),19,二、实验操作,目的：去除样品中分子量较小的杂质。,20,样品的处理及粗分离,1.红细胞的洗涤,3.分离血红蛋白溶液,2.血红蛋白的释放,采集血液,（血红蛋白的）纯化,（血红蛋白的）纯度鉴定,方法：,方法：,凝胶色谱法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,生理盐水,蒸馏水、甲苯,柠檬酸钠,4.透析,缓冲液,21,（二）凝胶色谱操作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网， 再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,1、凝胶色谱柱的制作（教材P67）,注意： 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,22,2、凝胶色谱柱的装填（教材P68）,凝胶的选择： 材料： 代表意义： 凝胶的前处理：,操作提示（教材P69）： 为了加速凝胶膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需12 h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶内的空气。,交联葡聚糖凝胶（G-75）。,G ：凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75：凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶，在蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，配成凝胶悬浮液。,（二）凝胶色谱操作,23,2、凝胶色谱柱的装填（教材P68）,凝胶色谱柱的装填： 将色谱柱装置固定在支架上。将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在。,洗涤平衡： 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。,（二）凝胶色谱操作,24,2、凝胶色谱柱的装填,操作提示（教材P70） ： 1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2.装填凝胶柱时不得有气泡存在。 3.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,（二）凝胶色谱操作,原因：气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,原因：如果不紧密，在色谱柱内会形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果,25,3、样品的加入和洗脱（教材P68-P69）,调节缓冲液面： 打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,（二）凝胶色谱操作,26,3、样品的加入和洗脱（教材P68-P69）,滴加透析样品： 吸管吸1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,（二）凝胶色谱操作,样品渗入凝胶床： 加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱： 小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,27,3、样品的加入和洗脱（教材P68-P69）,（二）凝胶色谱操作,操作提示： 1.不要触及并破坏凝胶面。 2.贴壁加样。 3.使吸管管口沿管壁环绕移动。,28,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。,操作提示（教材P70） ： 在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。,（二）凝胶色谱操作,样品的收集：,3、样品的加入和洗脱（教材P68-P69）,29,目的：,判断纯化的蛋白质是否达到要求。,目的蛋白,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,30,1.样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等 操作收集到血红蛋白溶液。2.样品的粗分离经过透析去除分子量较小的杂质。3.样品的纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质 蛋白除去。4.纯度鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。,你能描述血红蛋白提取和分离的完整过程吗？,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,31,1同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离，他在操作中加样的正确顺序是_，在执行图一中所示操作时，色谱柱下端连接的尼龙管应该_(打开或关闭)。,关闭,32,2.化学物质SDS能使蛋白质变性,解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入一定量的SDS,电泳迁移率取决于肽链的分子大小。如图为本实验中用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。,根据电泳结果,某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论,这种说法可靠吗?。理由是 。,不可靠只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链,不一定是两条,33,3.(广东)以下关于猪血红蛋白提纯的描述中，不正确的是()A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,D,34,4下列关于样品的加入和洗脱的操作不正确的是 ( ) A加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液 缓慢下降到凝胶面的下面 B加样后，打开下端的出口，使样品渗入凝胶床内 C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破 坏凝胶面,A,35,5.在血红蛋白分离的过程中，如果红色区带歪曲、散乱、变宽，与其有关的主要是 ( )A.血红蛋白的释放 B.样品的处理 C.洗脱过程 D.色谱柱的装填,D,36,6下列关于蛋白质的提取与分离的叙述，正确的是（ ） A在凝胶色谱柱内，分子量较大的蛋白质路程较长，但移动速 度较快 B从凝胶色谱柱中最后分离出来的是分子量较小的蛋白质 C蛋白质的纯化，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 D分离血红蛋白溶液时，离心管的第三层是脂类物质,B,37,【教材习题答案】（一）旁栏思考 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。,（二）结果分析与评价1. 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,38,2. 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,3. 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,39,课后练习答案1凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。,40,（三）练习2在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。 缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。,41,（三）练习3 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。,42,4血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,5血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,43,