SNP分子标记及其在水稻研究中的应用.doc

SNP分子标记及其在水稻研究中的应用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。目前SNP技术主要分为2大类，一类是以凝胶电泳检测为基础的，一类是以高通量检测为基础的。针对不同的研究工作，选用与之相适应的检测平台，将推进研究工作的快速进展。SNP已经成为水稻研究领域的一个重要工具，利用基因组中高密度分布的SNP分子标记，可以进行功能标记的开发、遗传图谱的构建、分子标记辅助育种、图位克隆和功能基因组学、等位基因、物种进化等方面的研究工作。 1 SNP分子标记的特点 SNP是Lander E 于 1996年首次提出的一种分子标记1，作为第3代分子标记，它具备以下几个特点：二等位多态性，即发生C-T，G-A的转换，或者C-A，G-T，C-G，A-T的颠换，前者发生概率为2/3；高通量、自动化的实验流程，包括芯片、测序等技术的应用；遗传稳定性高，SNP标记的突变率低，且能够在生物体基因组中稳定遗传，其遗传的稳定性高于SSR标记；在染色体上的覆盖率高，在人类基因组中，每3001000个碱基中即存在1个SNP；在水稻基因组中，每154个碱基即存在1个SNP2；SNP位点在基因内区域分布较多，有的位点可能与功能基因有关，可开发SNP功能标记。传统的分子标记本身和基因功能没有关系，而SNP功能标记和目标性状是完全连锁的，一旦遗传效应与功能序列基序相对应，此基序衍生的功能标记就可以在不需要其它测定的情况下在多个遗传背景中固定等位基因3。 2 SNP技术的介绍 近年来，随着分子生物技术的发展，SNP技术也迅猛发展。从检测的通量上可分为，以凝胶电泳为基础的检测方法和高通量、自动化程度较高的检测方法2大类，前者包括单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DDGE）、酶切扩增多态性序列（CAPS）、等位基因特异性PCR（AS-PCR）等，后者包括DNA测序、DNA芯片、变性高效液相色谱（DHPLC）、飞行质谱仪检测、高分辨率溶解曲线（HRM）、TagMan实时荧光法等4。高通量、自动化程度较高的方法也是目前比较常用的，其中DNA测序和HRM也逐渐被芯片技术和基于PCR基础上的技术所替代，各科研工作者可根据实际应用的不同需求选择相应的检测平台。 例如，在分子育种工作中或者SNP位点开发中，需要的是位点高通量的检测方法，那么芯片检测法则是最好的选择。芯片检测法的一个代表为Affymetrix公司的GeneTitan Multi-Channel平台，可适用于位点高通量的检测，该芯片是激光微刻芯片，理论上100%将所有侯选SNP 位点都设计到芯片上，结果准确可靠；所有操作均在Biomek FXp实现，管理操作很简单，且一周可以扫描768arrays或者3072arrays；另一个代表为Illumina公司的Infinium平台和GoladenGate平台，该芯片是光纤维珠芯片，Infimium芯片可用于位点更高通量的检测，而GoladenGate芯片的通量适合于位点数小于3072的研究；在品种真实性鉴定工作中，需要的是样品高通量的检测方法，那么英国LGC公司的KASP平台、美国Douglas的Array Tape平台甚至是基于PCR技术上的TagMan实时荧光法则比较适合。 3 SNP在水稻研究中的应用概述 3.1 水稻SNP功能标记的开发和应用 很多分子标记本身和基因功能没有关系，在杂交过程中标记会和目标性状发生分离，特别是和目标性状遗传距离较大的标记，而SNP功能标记能很好地解决这方面的问题。水稻的基因组全序列测定已经完成，有丰富的功能基因组及生物信息学方面的资源可以利用，使相关功能标记的开发更容易进行。随着一些重要农艺性状基因被克隆，很多水稻SNP功能标记也被开发，例如Pi-ta基因、Wx基因、Rc基因、Xa-5基因、fgr基因、GS3基因、S5基因、S-a基因、Hd3a等。这些基因由于SNP的改变，引起了氨基酸的变化，进而引起基因功能的变化，那么就能利用引起变异的SNP位点设计功能标记。这样，可以对材料进行快速筛查，分析具有目标基因的材料，对分子设计育种奠定了基础。 3.2 SNP在图位克隆和功能基因组学中的应用 利用SNP构建水稻精密遗传图谱，对目标基因进行精细定位，使目的基因定位在更窄的候选区间，甚至有些SNPs位点就在目的基因的编码区内，为基因克隆、功能互补试验带来许多方便。另外，在功能基因组学方面，1个SNP的改变也可能引起基因功能的改变。例如，与水稻产量性状相关的基因，GS3基因第2外显子中1个碱基C突变为A，使胱氨酸（TGC）突变为终止密码子（TGA，）使得水稻从在表型上从短粒变为长粒5。控制直粒穗形基因IPA1，由于第3外显子的C突变为A，扰乱了OsmiR156 对IPA1的调控，IPA1突变后，使得水稻分蘖减少、穗粒数和千粒重增加，同时茎秆变得粗壮，抗倒伏能力增强，进而提高产量5。 3.3 SNP在水稻进化中的应用 水稻的驯化是一个漫长的过程，在其进化过程中，SNP的改变也可能引起籼稻和粳稻的区分。例如，控制水稻籼粳杂种育性的广亲和基因S5n，在编码区273处，亮氨酸突变为苯丙氨酸，即A突变为C，导致粳稻突变为籼稻。控制水稻抽穗期的基因Hd17，研究者利用73个亚洲栽培稻（籼稻和粳稻）和37个野生稻测序，发现在第4外显子的一个SNP的变化，从T突变为C，使得氨基酸从L变为S，引起基因功能的变化，导致粳稻突变为籼稻。 3.4 SNP在水稻等位基因中的应用 已克隆基因在不同的水稻材料中存在着不同的等位基因，其表型也会有差异，即表型的效应也不一样。以水稻Wx基因为例，由于第1内含子T/G差异，第2外显子的一处缺失，第6外显子A/C差异，第9外显子T/C差异，第10外显子C/T差异，这5处SNP或者INDEL的差异，实验证明都引起了基因功能的变化，使得水稻材料的表型也分为5类7。这些等位基因的区分，有助于基因的功能分析和新等位基因的发现，也为水稻设计育种奠定了良好的基础。 4 结语 随着分子生物技术的不断发展，SNP技术也是日新月异，从以凝胶电泳检测为基础发展到现在的高通量自动化的技术，然而，SNP分子标记的开发和应用成本仍然比较高，随着SNP技术的进一步成熟，期望它的成本将能够大大降低，甚至比SSR标记的成本还低；在水稻育种研究工作中，SNP与目标基因存在一定的关联性，1个SNP的改变可能引起基因功能的改变，引起某些性状表型的变异，因此SNP发挥着其它分子标记无法比拟的重要作用。随着功能基因组学的不断进步，期望能更加快速发现水稻所有的SNP功能标记，加速育种技术的革新，创立新型的育种理论和体系。