β―壳聚糖的制备、降解及胆固醇吸附活性研究.doc

壳聚糖的制备、降解及胆固醇吸附活性研究一、概述 1.甲壳素和壳聚糖 甲壳素又名甲壳质、几丁质等，化学名-（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，广泛存在于节肢动物的外壳及某些微生物的细胞壁中，是自然界存在的第二大天然有机化合物，仅次于纤维素。甲壳素经强碱处理，脱乙酰形成壳聚糖，壳聚糖的化学名为-（1，4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，壳聚糖与纤维素有相似的结构，只是纤维素2位上是羟基，壳聚糖的是氨基。甲壳素与壳聚糖结构式如图1： 甲壳素与壳聚糖作为天然产物， 具有资源丰富、安全无毒、生物相溶性、生物可降解性、细胞亲和性、抗菌性等优点， 应用于诸多领域。但因其只溶于酸性介质，而不溶于水或一般有机溶剂，使其应用方面仍受到一定限制。 2.-壳聚糖 随着海洋渔业发展，每年都有大量的鱿鱼骨由于其不可食用性而作为生产垃圾丢弃，这不仅浪费资源，也污染环境。鱿鱼骨是重要的海洋资源-壳聚糖的主要来源。-壳聚糖具有不同于-壳聚糖的平行结构，导致其在制备方法和实际应用上，也与-壳聚糖有着明显差别。通常-壳聚糖较-壳聚糖具有相对弱的分子间作用力，因而溶解性、反应活性和对溶剂的亲和性更好。作为一种可再生的天然多糖材料，-壳聚糖已经广泛应用于伤口缝合和软骨损伤等医药领域，能够促进细胞再生、防止疤痕形成。此外研究发现，-壳聚糖具有更好的保水性和保湿性；同样条件下，-甲壳素更易脱乙酰基。 当下肥胖日益普遍，并带来一系列健康问题，过多摄入胆固醇是肥胖的起因之一。而目前尚缺乏对-壳寡糖后对胆固醇吸附能力的研究，通过实验研究可以为减肥药物的研发提供相关数据。 二、材料与方法 1.实验材料 鱿鱼骨（日本枪乌贼，Loligo Japonica）；1%的氢氧化钠溶液；4%的盐酸溶液； 过氧化氢；冰乙酸溶液；纤维素；胆固醇；氯化钠；油醇。 2.实验仪器 超声波微波组合反应系统（南京先欧仪器制造有限公司） 电子天平（Electronic Scale）；水浴锅（IKA HB10 digital） 立式压力蒸汽灭菌器（BOXUN）；超声波细胞粉粹机（宁波新芝科器研究所） 震荡培养箱ZQLY-180F（上海知楚仪器）；胆固醇试剂盒 高效液相色谱分析仪（Agilent Technologies） 3.处理方法 （1）制备-壳聚糖 将鱿鱼骨表面的组织残留物清洗干净后烘干，称取20g鱿鱼骨置于一定浓度盐酸中室温下浸泡7h，洗净至中性后置于1%的氢氧化钠中90，水浴反应2h进行脱蛋白，洗净至中性烘干，即得-甲壳素。称取5g-甲壳素，用40%的氢氧化钠95反应6-8 h脱乙酰基处理，即得-壳聚糖。 （2）-壳聚糖降解及分子量测定 称取12g自制-壳聚糖，溶解于400 ml浓度为2%的冰乙酸溶液（v/v），搅拌溶解直至获得澄清、均质的-壳聚糖。将50ml溶解后的-壳聚糖倒入100ml微波反应器中，加入30%过氧化氢1.5-3mL，600W，70条件下500r/min，依次反应5 min、10 min、20 min。反应结束后，微波炉内放置冷却510 min，取出，加1mol/l氢氧化钠中和，抽滤除去不溶物。滤液用34倍量无水乙醇充分沉淀，抽滤取滤液。最后检验产品是否溶于水。 将降解后的-壳寡糖透析，冷冻干燥得到粉末状壳寡糖样品，分别将反应5 min、10 min、20 min的样品进行高相液相色谱分析。 （3）胆固醇吸附活性研究 配制胆固醇胶束（PH=7.4，15mmol/L） 用超声波细胞粉碎机粉碎细胞。 实验设置实验组和对照组，对照组分别是空白组和纤维素组，实验组有5组，分别加入10、20、40、60、80mg的-壳寡糖（分子量约为5000）。所有组均加入5ml胆固醇胶束。 用振荡培养箱恒温振荡（37）培养两个小时，离心上清液，用胆固醇试剂盒测胆固醇吸附率。 三、结果 1.制备-壳聚糖成品（图2） 2.壳聚糖浓度与其胆固醇吸附能力的关系（表1） 四、结果分析 1.-壳聚糖处理时间与分子量结果分析 随着处理时间增长，波峰向右移动，根据公式，推算出分子量逐渐减小，得到结论：微波辅助过氧化氢降解时间越长，所得寡糖分子量越小（表2）。 2.胆固醇吸附率结果分析（图3） 不同剂量壳寡糖（分子量约为5000）对胆固醇的结合能力如图所示，当壳寡糖加入量小于40mg时，增大壳寡糖剂量，结合能力显著提高。但当壳寡糖加入量为40mg时，即使再增大壳寡糖剂量，结合能力也无显著性差异，说明结合已达饱和。 同等浓度时，-壳寡糖对胆固醇的结合能力远大于纤维素，即使纤维素浓度为-壳寡糖数倍，结合能力仍明显不足。 五、实验结论 结合上述分析及文献资料，可以发现： 微波辅助过氧化氢可降解-壳聚糖，得到分子量小的-壳寡糖。 降解时间与所得-壳寡糖分子量成反比。 在一定浓度范围内，-壳寡糖对胆固醇的吸附能力与浓度成正比。 与纤维素相比，-壳聚糖具有良好的胆固醇吸附能力。 六、前景及创新点 1.前景 本实验研究了-壳聚糖的降解与降解后的-壳寡糖对胆固醇的吸附能力，为进一步研究提供了数据及方向。 鱿鱼骨是一种一直未被利用的生物资源，具有产量大，成本低的优势，因此具有广阔的研究与利用前景。本实验中只测定了分子量约5000的-壳寡糖对胆固醇的吸附率，在进一步研究中，可以测定不同分子量的-壳寡糖的吸附能力，找出最佳吸附分子量，并进行动物活体实验，测定其具体的减肥功效及副作用，如条件允许，可以研发相关减肥药物，在肥胖率居高的今天，健康的减肥药物市场前景光明。同时，-壳聚糖目前尚无工业化生产方法，只能人力清洗鱿鱼骨并在实验室内处理，进一步研究也可以探索-壳聚糖的工业制备方法，为实际应用时的大规模生产奠基。 2.创新点 （1）使用-壳聚糖 目前国际研究以-壳聚糖为主，而对-壳聚糖的研究较少，因此研究-壳聚糖得出的成果更具有创新性。 （2）研究胆固醇吸附率 过多摄入胆固醇可引起肥胖，通过研究-壳寡糖对胆固醇的吸附，为进一步研究其对减肥的作用奠定基础，开辟-壳聚糖及-壳寡糖的新应用领域。