不同浸提剂及对照设置对土壤脲酶活性测定的影响.doc

不同浸提剂及对照设置对土壤脲酶活性测定的影响在土壤酶中，脲酶催化土壤中尿素酰胺态氮水解为铵态氮，在土壤氮元素的循环与转化过程中扮演重要角色1-3。脲酶活性是评价生态系统氮素转化机制及其功能演变时最常见的酶学指标。土壤脲酶活性的测定有比色法、扩散法、尿素剩余量测定法、电极法、CO2量度法等4-6多种方法，其中比色法由于测量结果精确性较高、重现性较好、仪器设备简单，应用最为广泛。非甲苯法7因为没有甲苯的加入因而更加注重脲酶对于尿素的水解功能，是比色法中最常应用的方法。对于非甲苯法，可以选择不同的浸提剂，如有的学者采用 2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4混合液或者1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl，在浸提剂加入的同时加入抑制剂阻止脲酶的进一步水解；而有的学者直接采用2.0 mol/L KCl进行浸提。并且对于对照的处理方法也不尽相同，有的是在土样培养之后加入底物尿素7；有的则是与处理同步加入底物，但对照处理不进行培养8。抑制剂是否可以有效地抑制酶的活性、这些不同的处理方式测出的脲酶活究竟会有什么差异，目前还缺乏相应的比较与研究。本研究以洪泽湖湿地为原型区域，采集湿地沉积物样品，采用非甲苯法并使用5种不同的浸提剂（1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.5 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl、1.0 mol/L KCl），同时设立对照培养2 h与对照不培养2种不同的对照试验，对脲酶活性进行检测，以期明确不同浸提剂及不同对照设置对土壤脲酶活性测定的影响。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验土壤取自于洪泽湖湿地，取020 cm的表层沉积物自然风干后，碾碎，过2 cm筛，备用。供试土样的全氮、全碳含量分别为0.675、0.1 g/kg。 1.2 试验方法 1.2.1 脲酶活性的测定 选用水杨酸钠-二氯异氰尿酸钠比色法测定脲酶活性6-11。（1）称取5 g土壤样品，置于 100 mL 的有盖容器内，加入2.5 mL 0.08 mol/L尿素水溶液，密封后在37 下恒温培养2 h。培养结束后，打开塞子，加入2.5 mL蒸馏水，然后加入50 mL 5种不同的浸提剂（1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.5 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl、1.0 mol/L KCl）振荡30 min，转速180 r/min，将振荡后的土壤悬浊液迅速过滤，取1.0 mL滤液于10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，摇匀，倒入25 mL小烧杯中，并依次加入 5 mL 的水杨酸钠和2 mL的二氯异氰尿酸钠溶液。室温下?o置30 min，以蒸馏水为参比，用紫外可见分光光度计在 690 nm 处测吸光度。每个样品3个重复，比较不同浸提剂对于土壤脲酶活性的差异。 1.2.2 第1种对照的设置 称取5 g土壤样品置于100 mL的有盖容器内，加入2.5 mL蒸馏水，密封，在37 下恒温培养2 h。培养结束后，打开塞子，加入浸提剂，再加入 2.5 mL 0.08 mol/L尿素水溶液（先加浸提剂再加尿素）。之后的步骤与处理试验中相同。 1.2.3 第2种对照的设置 在处理试验与对照试验中，处理与对照同时按相同试验步骤进行的，但对处理进行2 h培养，对照不培养，分析不同对照的设置对脲酶活性测定结果的影响。该对照下浸提剂使用1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.0 mol/L KCl。比较不同对照对于脲酶活性的差异。 1.2.4 脲酶活性的计算 脲酶活性用1 g干土1 h水解尿素产生铵态氮的量表示。 U=（T-CK）×17×55/（5×2）。 式中：U表示脲酶活性，g/（g?h）；T表示处理吸光度从标准曲线中查得铵态氮的浓度，g/mL；CK表示对照组吸光度从标准曲线中查得的铵态氮浓度，g/mL；17为取1.0 mL滤液共稀释17倍；55是处理和对照滤液制备前稀释的体积，mL；5为沉积物的干质量，g；2为换算成1 h的系数，h。 2 结果与分析 2.1 不同浸提剂对于脲酶活性的影响 由图1表明，对照培养条件下当浸提剂为1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl时，脲酶活性达到最强，为0.098 g/（kg?h），2.0 mol/L KCl次之，浸提剂为 2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4测得的脲酶活性最弱，为0.035 g/（kg?h），最大值为最小值的2.8倍。当浸提剂分别为 1.0 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl、2.5 mol/L KCl时，脲酶活性分别为0.062、0.072 0、0.036 g/（kg?h），KCl浓度从 1.0 mol/L 增至2.0 mol/L时，脲酶活性增加 0.01 g/（kg?h）；当浓度继续升高至2.5 mol/L时，其脲酶活性比2.0 mol/L KCl 低 50%。比较1.0、2.0、2.5 mol/L KCl等3种不同KCl离子浓度浸提剂相应酶活性的变化可以看出，脲酶活性与浸提剂的离子浓度并不是呈现明显的正相关关系，而是先增强后减弱，在2.0 mol/L KCl时测得的脲酶活性最强，这可能是因为低浓度浸提剂对铵根离子的提取效率相对较低，但并不是浓度越高就越有利于提取；高浓度可能影响到脲酶活性的比色，进而减弱脲酶活性。从表1可以看出，离子浓度的升高，使得脲酶活性差异显著。不同浓度下，脲酶活性之间均差异显著（P