中药制剂含量测定中药分析学云南中医学院-文档资料.ppt

含量测定的目的与意义,目的,通过制剂中某种成分的含量高低是否符合规定来判定药物的优劣,意义,保证中药制剂的质量，达到临床用药有效、安全、稳定,中药制剂含量测定的特点,中药制剂与化学药品含量测定区别,含量测定的目的与意义,二、含量测定方法 中药制剂含量测定的方法包括化学分析法和仪器分析法两大类。由于中药制剂组成复杂，仪器分析法更为常用。中国药典中药制剂含量测定方法概况见下表。 本章重点介绍浸出物测定法、挥发油测定法、分光光度法 、TLCS、 HPLC 和GC等。,方法 总数 修订 新增 删除 HPLC 339 30 282 0 TLC 32 3 12 12 GC 23 3 19 0 分光光度法 18 0 3 9 滴定法 13 0 3 0 重量法 5 0 1 1 氮测定法 5 1 1 0 挥发油测定法 3 0 0 1 浸出物测定法 13 1 2 1 总计 456 37 327 23,仪器分析法,化学分析法,第一节 含量测定样品的处理,1.除去杂质、纯化样品，提高分析方法的重现性和准确度 2.富集浓缩或进行衍生化 3.制成便于分析测定的稳定试样 4.使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求,作 用,1. 粉碎 2. 提取 3. 分离净化,步 骤,第一节 含量测定样品的处理,第一节 含量测定样品的处理,一、样品的粉碎 目的： 1.保证所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度 2.加速被测定组分的提取完全,第一节 含量测定样品的处理,一、样品的粉碎 1.避免过细 2.避免样品受污染 3.避免粉尘飞散及挥发性成分的损失 4.避免丢弃不易通过筛孔的部分颗粒 粉碎机、研钵；高速匀浆机、玻璃匀浆器,细粉：全部通过5号筛（80目），并含能 过6号筛（100目）不少于95的粉末,注意,设备,第一节 含量测定样品的处理,二、样品的提取 冷浸法 回流提取法 连续回流提取法 超声提取法 超临界流体提取法,供试品的制备方式 1.部分测定法（等量法）： 即将浸泡后的溶液，用适宜滤器滤过，精密量取一定体积，进行测定 注：此法不适宜挥发性较大的提取溶剂,第一节 含量测定样品的处理,重量法定容,第一节 含量测定样品的处理,供试品的制备方法 2.全部测定法（即总量测定法）：将浸泡后的溶液滤过，滤渣充分用溶剂洗涤至提取完全，合并滤液及洗液，浓缩或蒸干，残留物用另一溶剂溶解，定量转入量瓶中，稀释至刻度，摇匀，进行测定 注意： 转移完全,乙肝宁颗粒 （黄芪甲苷） 中国药典 2005年版一部P291,供试品溶液的制备 取装量差异下的本品，研细，取约5g或1g（无蔗糖），精密称定，加水20ml使溶解，用以水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液20ml分2次洗涤，取正丁醇液，用以正丁醇饱和的水20ml分2次洗涤，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。,三、样品的分离净化（色谱法） 固相萃取（ Solid-Phase Extraction ）/液-固萃取（Liquid-Solid Extraction) 当目标分析物与SPE填料极性相似时，样品流过SPE柱后，目标化合物在填料上有较好的保留，而极性与填料相差较远的非目标化合物或杂质直接流出，再用适当洗脱液把目标化合物洗脱、收集，可直接分析或浓缩后分析；或使杂质保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。,原 理,常用定量分析方法,第一节 浸出物测定法 （Determination of Extractive） 一、定义 浸出物测定法系根据制剂中化学成分的溶解性，选择适当的溶剂浸提(提取)样品，并测定浸出物（提取物）的含量，以此来控制药品的质量。,二、意义 这是一种较为粗略的定量分析方法。但对于有效成分不明确或无法建立确切的定量分析方法的中药材及其制剂，尚具有一定的意义。 中国药典附录收载了三种测定方法：水溶性浸出物测定法、醇溶性浸出物测定法和挥发性醚浸出物测定法。有的品种还采用了乙酸乙酯浸出物测定法。 供试品需粉碎，使能通过二号筛，并混合均匀。,三、水溶性浸出物测定法 本法系以水为溶剂，对制剂中水溶性成分进行提取，并计算其在制剂中的含量(%)。本法包括冷浸法和热浸法。后者适用于不含或少含淀粉、粘液质等成分的样品。 1冷浸法 取供试品约4g，称定重量，置250300ml的锥形瓶中，精密加入水100ml，塞紧，冷浸，前6小时内时时振摇，再静置18小时，用干燥滤器迅速滤过，弃去初滤液，精密量取滤液20ml，置己干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴蒸干后，于105干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量（W/W %）。,含量（W/W %） = ×100% mi 为水溶性浸出物重量（g） ms为干燥供试品的重量（g）=供试品重量×（1含水量%)） 2.热浸法(中成药较少用 自学) 3.实例 暑症片的水溶性浸出物测定（P128）,四、醇溶性浸出物测定法 本法系以甲醇、乙醇或正丁醇为溶剂，提取药品中相应的醇溶性成分，并计算其含量（%）。正丁醇浸出物测定法主要用于含较多皂苷类成分的制剂，更具专属性。 1.甲醇、乙醇浸出物的测定 照水溶性浸出物测定法测定。 2.正丁醇浸出物的测定 按各品种项下规定的方法测定。一般说来，水溶液制剂可直接用水饱和的正丁醇提取数次，合并提取液，置已干燥恒重的蒸发皿中，蒸干，置105干燥3小时，移置干燥皿中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算供试品中正丁醇浸出物的含量（W/V %）。固体制剂可先加水溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取数次，合并提取液，照上述方法蒸干，干燥，称定浸出物重量，计算出制剂中正丁醇浸出物的含量（W/W %）。,3.注意事项 （1）回流加热乙醚须在水浴上进行。 （2）蒸发皿中挥去乙醚须在室温下风橱中进行。 （3）加热挥去浸出物中挥发性成分时，应缓缓加热至 105 4.实例 （1）儿康宁糖浆正丁醇浸出物的测定 （2）刺五加浸膏的甲醇浸出物测定,五、挥发性醚浸出物测定法 本法以乙醚为溶剂，对制剂中挥发性醚溶性成分进行提取，并计算其在制剂中的含量（W/W %）。本法主要用于含挥发性成分较多的制剂，专属性较强。 1.测定法 取供试品（过四号筛）25g，置五氧化二磷干燥器中，干燥12小时，精密称定重量（ms）,置索氏提取器中，加乙醚适量，除另有规定外，加热回流提取8小时，取乙醚液，置干燥至恒重的蒸发皿中，放置，挥去乙醚，残渣置五氧化二磷干燥器中，干燥18小时，精密称定（m1），缓缓加热至105，并于105干燥至恒重（m2）。其减失重量即为挥发性醚浸出物的重量（m1-m2）。计算，即得。 含量（W/W %） = ×100%,2.实例 九味羌活丸的挥发性醚浸出物测定 本品由羌活、防风、苍术、细辛、川芎、白芷、黄芩、甘草、地黄等九味中药组成，其主要有效成分为挥发油，故测定其中挥发性醚浸出物的含量。,练习,第二节 挥发油测定法 （ Determination of Volatile Oil） 一、意义 某些药品中的主要有效成分为挥发油，故中国药典收载了挥发油测定法，采用水蒸气蒸馏法对药品中挥发油总量进行测定，以控制药品质量。例如，正骨水、牡荆油胶丸、保妇康栓和满山红油滴丸等中挥发油的测定。 二、测定原理 首先利用挥发油的挥发性用水蒸气蒸馏法将其提取完全；再利用其较强的亲脂性与水不相溶而分层，即可读取油的总量并求算出含量。,三、测定方法 供试品需粉碎后过二号至三号筛，混匀再测定。 1.甲法 本法适用于测定相对密度在1.0以下的挥发油。取供试品适量（约相当于挥发油0.5ml1.0ml），称重（准至0.01g），置烧瓶中，加水300ml500ml（或适量）与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中或用其他适宜方法缓缓加热至沸，并保持微沸约5小时，至测定器中油量不再增加，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线上面5mm处为止。放置1小时以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，计算即得。,2.乙法 本法适用于测定相对密度在1.0以上的挥发油。取水约300ml与玻璃珠数粒，置烧瓶中，连接挥发油测定器。自测定器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶时为止，再用移液管加入二甲苯1ml，然后连接回流冷凝管。将烧瓶内容物加热至沸，并继续蒸馏，其速度以保持冷凝管的中部呈冷却状态为度。30分钟后，停止加热，放置15分钟以上，读取二甲苯的容积。然后照甲法自“取供试品适量”起，依法测定，自油层中减去二甲苯量，即为挥发油量，计算即得。,五、含量计算 含量（V/W ）= ×100% 含量（V/W ）= ×100% 含量（V/W ）= ×100% 挥发油体积（ml） 样品体积（ml） 样品重量（g） 挥发油密度（g/ml）,VO,WS,WS,VO ×DO,VS,VO,VO,WS,DO,VS,练习,化学分析法,化学分析法,重量分析法,滴定分析法,挥发法,萃取法,沉淀法,酸碱滴定,沉淀滴定,配位滴定,氧化还原滴定,化学分析法,仪器简单，结果准确 主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分 总生物碱 总酸类 总皂苷 矿物药制剂,练习,练习,练习,练习,练习,第三节 可见-紫外分光光度法 （Ultraviolet and Visible Spectrophotometry） 一、定义 根据被测物质在可见-紫外光的特定波长处或一定波长范围内光的吸收度对该物质进行定性定量分析的方法称可见-紫外分光光度法。,紫外分光光度计工作原理,紫外吸收光谱图,二、特点 本法操作简便，灵敏度高，常用于中成药含测。但本法不具分离功能，常用于总成分的测定。 三、定量分析的理论基础 朗伯比尔定律 A = K C L A为吸收度 K为吸收系数 C为溶液浓度 L为溶液厚度,四、药典收载了三种测定方法 1.吸收系数法 仅用于UV,不需对照品。 2.对照品比较法 主要用于Vis,需用对照品。 3.标准曲线法 主要用于Vis,需用对照品。 （原计算分光光度法取消）,练习,练习,第四节 薄层扫描法 （ Thin Layer Chromatography Scan TLCS ） 一、定义 薄层扫描法（TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量分析的方法。,二、特点 具有分离分析双重功能。与高效液相色谱法比较，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。目前随着制板、点样、展开等操作的仪器化及仪器性能的改进，该法检测的灵敏度，结果的精密度与准确度均大大提高，在中药及其制剂检验中，已成为重要的分析方法。中国药典中有32个中成药品种采用该法进行含量测定。,三、仪器及其工作原理 1.薄层扫描仪 中国药典采用双波长薄层扫描仪。常用的有岛津CS-930型和CAMAG-型等。 2.扫描仪工作原理,3.测定方式 （1）吸收法 适用于有紫外（可见）吸收的成分，较常用。该法又可采用反射法或透射法测定。理论上讲，透射法比反射法优越，但实际工作中常用反射法，因为紫外光不能通过玻板。 （2）荧光法 适用于有荧光性质的成分，例如小檗碱等。该法仅采用反射法测定，其灵敏度比吸收法高。,4.测定波长 （1）单波长 一般用于荧光测定法，即用某一波长的紫外光（激发光）进行扫描。对玻板和斑点的质量要求较高。 （2）双波长 主要用于吸收测定法。该法可消除背景干扰，对玻板和斑点的质量要求不高，故较常用。测定时，样品波长（s）和参比波长（R）依次扫描斑点，所测吸收度为A=As AR 样品波长（s）：即被测成分的max 参比波长（R）：即被测成分的min或此波长处无吸收。,5.光束扫描方式 （1）直线扫描 适用于规则的斑点，仅用于荧光测定法。 （2）锯齿扫描 适用于不规则的斑点，测量误差小，被测成分积分值重现性好，故吸收测定法常用此扫描方式。 6.光源 （1）钨灯（W） 供可见光（350800nm）测定，扫描有色成分的斑点。 （2）氘灯（D2） 供紫外光（200400nm）测定，扫描有紫外吸收的成分斑点。 （3）氙灯（Xe） 供荧光测定，发射不连续光谱，常用波长为365nm。,四、含量测定方法（外标法） TLCS含量测定有外标法和内标法，中国药典仅采用外标法。 1.原理 外标法系将一定量的供试品溶液和对照品溶液分别点加在同一块薄层板上，展开，显色，定位，扫描被测成分和对照品斑点，测得相应的吸收度或荧光强度积分值，根据定量关系，计算出被测成分的含量。 2.类型 根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为外标一点法和外标两点法。 若标准曲线通过原点，采用外标一点法。 若标准曲线不通过原点，采用外标两点法。,外标一点法的直线方程： C = F A F 为斜率 外标两点法的直线方程：,、,F1为斜率,F2为截距,3.操作步骤 （1）对照品溶液的制备 （2）供试品溶液的制备 （3）点样 一般要求使用市售薄层板。 外标一点法：至少6个原点 对照品（R）2个（同一质量）：2R 供试品（S）4个（同一质量）分2组：2S1 2S2,外标两点法：至少8个原点,对照品（R）4个 分2组 大质量的2个：2R1 小质量的2个：2R2 供试品（S）4个（同一质量）分2组： 2S1 2S2 对照品与供试品应交叉点加在同一块薄层板上，目的在于消除各种误差。测定时应保证供试品原点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量。,外标两点法,外标一点法,（4）展开 （5）显色定位 供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。 （6）扫描 应沿展开方向扫描，不得横向扫描。 （7）含量计算 外标一点法 求出供试品被测成分（斑点）的质量,Ms被测成分的质量（M n=2） MR被测对照品的质量 As被测成分吸收度（荧光强度）积分值（A n=2） AR被测对照品吸收度（荧光强度）积分值（A n=2）,_,_,_,求出供试品中被测成分的含量,含量（W/W） =,Ms X 稀释倍数,取样量,含量（W/片） =,Ms X 稀释倍数 X 平均片重,取样量,外标两点法,求出供试品斑点中被测成分的质量,Ms = C +V1C,(V2-V1) (A-A1),(A2-A1),Ms被测成分的质量（mg n=2） A1对照品小点样量吸收度 V1对照品小点样量（l） （荧光强度）积分值（A n=2 ） V2对照品大点样量（ l ） A2对照品大点样（荧光强度） A被测成分吸收度（荧光强度） 积分值（A n=2） 积分值（A n=2） C对照液的浓度（mg/ml）,-,-,-,_,五、应用实例 1.九分散中士的宁的含量测定 九分散是由马钱子粉、麻黄、乳香和没药等制成。马钱子粉中含有士的宁、番木鳖碱等生物碱，具生理活性但也有毒性，故需控制马钱子含量。中国药典规定按干燥品计每包含马钱子以士的宁计应为4.55.5mg。 供试品溶液的制备 取本品10包，混合研匀。精密称取2g置具塞锥形瓶中，精密加氯仿20ml与浓氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放置24小时，再称重，补足氯仿减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取滤液10ml，用硫酸溶液（3300）分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液使呈碱性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，残渣中精密加氯仿5ml使溶解，作为供试品溶液。,对照品溶液的制备 取士的宁对照品，加氯仿制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。 测定法 吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液。（161214）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长：s=254nm ，R=325nm ，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。已知：AR19663.07， As20617.25，取样量2.098g。 解答问题 采用外标一点法还是外标两点法？ 采用什么方法显色定位？ 计算每包药品中马钱子的含量。（保留两位有效数字）,求出供试品斑点中士的宁的质量 求出供试品中士的宁的含量,Ms = MR X =5 l x 0.4 g/ l x =2.1g,As,AR,19663.07,20617.25,含量（mg/包）=,Ms X 稀释倍数 X 标示重量,取样量,=,0.0021mg X 5ml X 20ml X 2.5g/包,0.005ml X 10ml X 2.098g,= 5.0（mg/包）,2.枳实导滞丸中橙皮苷的含量测定 本品系由枳实、大黄和黄连等八味药材制成的水丸。中国药典规定按干燥品计算，每1g含枳实以橙皮苷（C28H34O15） 计，不得少于20.0mg。 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定（0.5124g），置索氏提取器中，加甲醇90ml，加热回流4 小时，趁热滤过至100ml 量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液与滤液合并，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5ml ，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。,对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品，加甲醇制成每1ml 含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。 测定法 精密吸取供试品溶液5、对照品溶液2 与5 ，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇为展开剂，展开，展距约3cm ，取出，晾干，喷以 1三氯化铝的甲醇溶液，放置3 小时，在紫外光灯(365nm) 下定位。上机进行荧光扫描，激发波长：330nm ,线性扫描，测量供试品与对照品荧光强度的积分值（AR(2 ) =885.7 AR (5 ) =979.4 AS=835.6），计算，即得。 聚酰胺TLC分离黄酮类成分效果较好故选之。 橙皮苷与AlCl3反应显色，在330nm紫外光下发射较强的绿色荧光（波长：500nm）。,回答问题： 本法采用的是吸收测定法还是荧光测定法？外标一点法还是外标两点法？透射法还是反射法？直线扫描还是锯齿扫描？光源是什么？ 求算枳实（橙皮苷）的含量（保留三位有效数字），并判断是否符合药典规定。,(V2-V1) (A-A1),(A2-A1),求算出斑点中橙皮苷的质量 Ms = C +V1C,=, 0.05mg/ml +2ul 0.05mg/ml,(979.4 885.7),(5ul2ul) (835.6885.7),=0.0198ug(1.98 X10 mg),求算出枳实（橙皮苷）在药品中的含量,含量（mg/g）=,Ms X 稀释倍数,取样量,=,-5,1.98 X10 mg X 2.5 X 10 ul X 1.0 X 10 ul,-5,5,5,5ul X 5 X 10 ul X 0.5124g,3,=38.6,练习,练习,第五节 高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatograph HPLC） 一、定义 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称为高效液相色谱法。 二、特点 高分辨，高灵敏，快速，适用范围宽，自动化程度高。 特别适合中药的定性定量分析，中国药典中大多 数中成药的含量测定采用此法。,三、类型 按原理分类主要有： 键合相HPLC 正相键合相HPLC 少用 反相键合相HPLC 最常用十八烷基键合固定相 (C18或ODS)常用甲醇-水、乙腈-水作为流动相 吸附HPLC 离子交换HPLC 凝胶过滤HPLC 亲和HPLC 胶束HPLC 手性HPLC,四、色谱仪及其工作原理,1.高效液相色谱仪 一般由高压输液泵、进样阀、色谱柱、检测器和数据处理系统或色谱工作站组成。 2.工作原理 系用高压泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，通过进样阀注入样品溶液，流动相携带样品进入色谱柱进行分离，被分离成分依次进入检测器，转变成相应的电信号，由数据处理系统或色谱工作站进行处理而得到分析结果。,二、含量测定方法（外标法 ） 内标法 外标法 药物分析大多采用此法 1.系统适应性试验 包括色谱柱的理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中分离度和重复性更具实用意义。 系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统进行试验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作适当的调整。,（1）色谱柱的理论板数（n）考察柱效 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的对照物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(Wh/2),按下式计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最 小理论板数，应改变色 谱柱的某些条件（如柱 长、载体性能、色谱柱 充填 的优劣等），使 理论板数达到要求。,（2）分离度（R） 考察分离效果 在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定，分离度应大于1.5。,（3）重复性 考察测量的精密度 在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样35次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0。 （4）拖尾因子（T） 考察色谱峰的对称性，保证测量的准确度。特别是采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.951.05之间。,式中: W0.05h为0.05峰高处的峰宽； d1为峰极大至峰前沿之间的距离。,2.对照品溶液的制备 3.供试品溶液的制备 4.测定法 将上述两种溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，按下式计算被测成分的含量。 （1）求出供试液中被测成分的浓度C供 （2）求出药品中被测成分的含量,C供C对,A对,A供,C供 X 稀释倍数,含量（W/W）,取样量,三、应用实例 1.牛黄解毒片中黄芩的含量测定 本品由牛黄、大黄、黄芩、冰片、石膏等八味中药制成。中国药典以黄芩苷为指标，采用HPLC测定其中黄芩的含量。 （1）色谱条件与系统适应性试验 固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相：甲醇-水-磷酸（45550.2），流速1ml/min； 检测器：紫外检测器，检测波长为315nm；理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。 （2）对照品溶液制备 精密称取在60减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，以甲醇溶解配成每1ml中含31.2µg的对照品溶液。,（3）供试品溶液制备 取牛黄解毒片20片，剥去糖衣，精密称定（6.254g），研细，精密称取1.045 g，加70%乙醇30ml，超声处理20分钟，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤于同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。 （4）测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl进样，测得对照品及供试品中黄芩苷的峰面积分别为A供4340441，A对3945856。,【解答】 采用的是外标法还是内标法？ 流动相中为什么要加入少量磷酸？ 计算黄芩苷的含量 （保留两位有效数字）。 求算供试液中黄芩苷的浓度,求算药品中黄芩苷的含量,黄芩苷（mg/片）=,C供×稀释倍数×平均片重,取样量,=,34.3（µg/ml）×10 ×50ml×312.7mg/片,1045mg,=0.51,-3,2.藿香正气水中厚朴酚与和厚朴酚总量的测定 本品由苍术、陈皮、厚朴（姜制）、白芷等十味中药制成的液体制剂，每支装10ml（标示装量）。其中厚朴为要药之一，故中国药典采用HPLC，以厚朴酚及和厚朴酚的总量为指标，控制厚朴的含量。 （1）色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-乙腈-水（50:20:40）为流动相；检测波长294nm。理论板数按厚朴酚峰计算应不低于5000。 （2）对照品溶液的制备 取厚朴酚、和厚朴酚对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含厚朴酚0.2mg、和厚朴酚0.1mg的溶液，摇匀，即得。,（3）供试品溶液的制备 精密量取装量项下的本品5ml，加盐酸2滴，用氯仿振摇提取3次，每次10ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解并精密稀释至10ml，精密量取5ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 （4）测定法 精密吸取上述三种溶液各10l，分别注入液相色谱仪测定，根据对照品的峰面积（AR厚 AR和）以及供试品中被测成分的峰面积（AS厚 AS和）计算厚朴的含量。本品每支含厚朴以厚朴酚（ C18H18O2 ）及和厚朴酚（C18H18O2）的总量计，不得少于5.8mg。 2.和厚朴酚 3.厚朴酚 5.6.其他成分峰,混合对照品. 和厚朴酚 厚朴酚 样品,【解答】 采用的是外标法还是内标法？为什么要酸化样品溶液，再用氯仿萃取？计算厚朴的含量 （保留两位有效字）。 【含量计算】 分别求算供试液中厚朴酚及和厚朴酚的浓度（mg/ml） 分别求算药品中厚朴酚及和厚朴酚的含量（mg/支） 求算厚朴酚及和厚朴酚的总量 （参考习题集第六章第37题 三黄片中大黄的含量测定）,C对为厚朴酚或和厚朴酚对照溶液的浓度； A供为供试品中厚朴酚或和厚朴酚的峰面积； A对为对照品厚朴酚或和厚朴酚的峰面积。,含量（mg/支）,5ml ×5ml （ 取样量）,C供mg/ml ×10ml ×10ml×标示装量ml/支,四、安全操作注意事项 1.流动相需用微孔滤膜（0.45m）滤过并脱气才可使用。 2.开泵后，先打开冲洗键（PURGE）进行泵排气。然后将流动相接入色谱柱充分冲洗平衡，待基线稳定后方可进样。 3.测试溶液需用微孔滤膜（0.45m）滤过。 4.使用键合硅胶柱，流动相的PH值应控制在28，否则色谱柱很容易损坏。 5.由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于使用C18柱的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5。否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值的改变，造成色谱系统的不稳定。 6.工作完毕，应先后用水和甲醇充分冲洗液路系统，尤其是使用了含盐的流动相，更应充分冲洗。,第六节 气相色谱法 （Gas Chromatography GC） 一、定义 以气体为流动相（亦称载气）的色谱分析法称气相色谱法（GC）。 二、特点 分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快等。在主要用于中药制剂中挥发油及其他挥发性组分的含量测定，还可用于水分、乙醇量的测定。但本法也存在一定局限性，它对挥发性差或遇热易分解破坏的物质难以分析。,三、分类 1.按固定相状态分类：气固GC、气液GC 2.按分离原理分类：吸附GC、分配GC 3.按色谱柱分类：填充柱GC、毛细管柱GC （分辨率高（n10 ）常用于农残分析）,四、仪器及其工作原理 工作原理 加热分析样品使其气化，由载气带入色谱柱，由于各组分在固定相与载气间分配系数不同，故在色谱柱中移动速度不同，经一段时间后彼此得到分离，再依次被载气带入检测器，将各组分的浓度或质量转换成电信号并记录成色谱图，根据色谱图的峰高或峰面积而进行定量分析。,五、含量测定 内标法 常用于药物分析。 外标法 少用，因为GC进样量小，造成的误差较大。 1.色谱条件和系统适应性试验 （1）色谱条件 主要包括载气、色谱柱、检测器、固定液（相）测试温度、进样量、载体等。其中检测器种类、固定液品种、以及色谱柱的材质不得改变，其它的如柱子的内径和长度、载体的种类和粒度、固定液涂布的浓度、载气的流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等可适当改变，以适应系统适用性试验的要求。,载气：一般为N2，还可用H2、He。 色谱柱：玻璃柱和不锈钢柱。 检测器: 氢火焰离子检测器（氢焰检测器 FID） 适合有机物检测，灵敏度高，应用广泛。 热导检测器（TCD） 无机物、有机物均可检测，灵 敏度较低，用于水分测定。 电子捕获检测器（ECD） 适合含卤素、硫、氮等电 负性强的元素的化合物测定。用于农残测定。,柱填料： 吸附剂：硅胶、氧化铝等。较少用。 高分子多孔小球：常用二乙烯苯乙基乙烯苯型的。气固吸附GC 例如甲（乙）醇量、水分的测定。 涂渍固定液的载体（多用）：常用经酸洗并硅烷化的硅藻土（ 红色载体、 白色载体）属气液分配GC。 固定液：常用甲基聚硅氧烷（如SE-30、OV-17等）、 聚乙 二醇（如PEG-20等），一般涂布浓度为525。 （2）系统适应性试验（同HPLC）,2.内标法（同乙醇量测定法） （1）标准液的制备 （2）供试液的制备 （3）校正因子（f）的测定 内标法特有的参数。,内标法测定时，同一检测器对不同（被测成分和内标物）具有不同的响应值，故不能用峰面积直接计算的被测成分的含量，要引入校正因子。 校正因子（f ） 药典中采用的是相对重量校正因子（fw）。其定义为：被测成分（i）单位峰面积所相当的物质量（Mi/Ai）是内标物（s）单位峰面积所相当的物质量（Ms/As）的多少倍。 内标物的选择原则： 应是样品中不存在的纯物质。加入量应接近于被测成分。其色谱峰应位于被测成分色谱峰附近且与之完全分离。,六、应用实例 十滴水软胶囊中樟脑含量的测定 本品由樟脑、干姜、大黄、小茴香、肉桂、辣椒、桉油等七味中药制成，樟脑是其主成分之一，具升华性，故采用气相色谱法，以樟脑为对照品，薄荷脑为内标物，对其进行含量测定。 1.色谱条件与系统适用性试验 以聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%，柱温150。理论塔板数按樟脑峰计算应不低于2000，樟脑峰与内标物质峰的分离度应大于2。,2.校正因子测定 精密称取樟脑对照品（r）50mg，置10ml量瓶中，精密加入薄荷脑内标物质(s)50mg，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取12l，注入气相色谱仪， Ar=211948、As=215835，计算校正因子（保留四位有效数字） 。 3.测定法 取装量差异项下的内容物，混匀，取0.8g，精密称定（0.7956g），置具塞试管中，用无水乙醇提取5次，每次4ml，分取乙醇提取液，合并，转移至25ml量瓶中，精密加入薄荷脑125mg，使溶解，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(is)。精密量取12l，注入气相色谱仪测定， Ai108685、 As123544，计算即得（保留两位有效数字)。,解答问题 本法属于气液分配GC还是气固吸附GC？ 使用哪种载气？哪种检测器？ 采用的是外标法还是内标法？ 求算樟脑的含量。药典规定，本品每粒含樟脑不得少于53mg。（平均粒重0.425g粒） 求算校正因子（f） f =(As/AR) X(MR / Ms ) = (215835/ 211948)/(50mg/50mg) 1.108 求算供试液中樟脑的浓度Ci（mg/ml）,Ci= f Cs=1.108 X X 5mg/ml=6.30 mg/ml,As,Ai,123544,108685,求算药品中樟脑的含量（mg粒）,含量,795.6mg,6.30mg/ml X 25ml X 425mg/粒,84,第七节 含量测定方法的验证,需验证的分析项目 1. 鉴别试验； 2. 杂质定量或限度检查； 3. 原料或制剂中有效成分含量测定； 4. 制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定； 5. 溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。,一、准确度 是指以测得结果与真实值之间的接近程度。由于真实值是未知的，故常用回收率试验来表示。 二、精密度 是指一种均匀样品经多次取样重复分析后，各次结果之间的符合程度。常用标准偏差或相对标准偏差表示。重复性、中间精密度及重现性,第七节 含量测定方法的验证,1. 重复性 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测 三次；或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。 2. 中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结 果的精密度。考察随机变动因素的影响。变动因素为不同日期、不同分 析人员、不同设备。 3. 重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将 被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协 同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草 说明中。,第七节 含量测定方法的验证,三、专属性 是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确，专一 地测定分析物的能力。（常用阴性对照法） 四、检测限 检测限是指在规定的实验条件下，分析方法能够检测（但不需要 定量）样品中分析物的最低浓度。 1非仪器分析目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。 2. 信噪比法,第七节 含量测定方法的验证,五、定量限 是指在规定的实验条件下和具有可接受的精密度和准确度前提 下，分析方法能够测定样品中分析物的最低浓度。 六、线性 七、范围 八耐用性 是指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的程度为常规检验提供依据。衡量方法不受参数微小变差影响的能力。,第七节 含量测定方法的验证,分析方法效能指标的要求 1、用于鉴别试验：只对专属性、耐用性二项指标有所要求，其余均无须要求 2、杂质测定或制剂中降解物测定：当用于定量除检测限不必要求外，其余七项指标均应有所要求；用于限度检查只对专属性、检测限、和耐用性有要求。 3、用于原料药中主成分或制剂中有效成分含量测定及溶出度测定，除了检测限和定量限外，其余均要求。,第七节 含量测定方法的验证,