深圳大学MTT比色法测定细胞生长曲线细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算-精选文档.ppt

1.MTT比色法测定细胞生长曲线,细胞生长曲线,细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。,一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的迟缓期（潜伏期），即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入稳定期，然后退化衰亡。 以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。 一般而言，我们主要研究的是对数生长期的生长曲线。,测定细胞生长曲线的方法,1.细胞计数法（简单、最常用、有误差） （1）传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中 （2）24 h后开始进行细胞计数，以后每隔24 h计数一次，每次取4孔细胞，分别进行计数，计数结果取4孔的平均值。连续计数6天。 （3）根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 24孔板 细胞计数板,2.MTT法（复杂，误差小）,原理 MTT：全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 汉语化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。 活细胞的线粒体中琥珀酸脱氢酶能够使外源性的MTT还原，同时在细胞色素C 的作用下，生成不溶于水的蓝色（或蓝紫色）络合物甲臜。 按照时间间隔，通过酶联免疫检测仪在490nm（或570nm）波长处测定甲臜 的光吸收值（A值）。 在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光吸收值推算出活细胞的数目。 由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入 MTT 不会有反应。,1.标准曲线的测定: 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到细胞悬液，按照4x104/ml细胞密度梯度 ,分别接种于 96孔板 ,每孔 100l,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值为该浓度下3孔的平均值。 依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度的对应关系，绘出标准曲线。 2.细胞生长曲线的测定: 例如：用培养液将待检细胞制成 1×104/ml的细胞悬液;分别接种于多块96孔板 ,每孔 100l ;在 24、 48、 72、 96及 120 h时间点取一块 96孔板 ,采用 MTT法测量吸光值A值得到吸光值A值与时间的关系。 根据标准曲线计算出相应的细胞数 ,再绘出细胞的生长曲线。,2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算,曲线拟合 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类型来拟合观测数据，并用拟合的曲线方程分析两变量间的关系。 SPSS SPSS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功，同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、在芝加哥组建了SPSS总部。 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围，并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社会科学的各个领域。,通常地，细胞生长曲线的函数拟合模型是 但由于细胞增值是二次分裂生长，所以选用 作为细胞生长曲线的拟合模型更为合适。,又因为在SPSS中的曲线拟合功能选项中并没有 的 函数拟合模型，只有 于是我们可以通过变换 从而能使用SPSS中的函数拟合模型进行曲线拟合。,原始数据,曲线1. 培养天数 X ln2 曲线2. 进入对数生长期天数 X ln2 依据以上变量进行曲线拟合,记录相应的a,b值。,2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法,细胞群体倍增时间的计算方法有2种。 1.做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间, 2.公式法,按细胞倍增时间计算细胞群体倍培时间,其为公式为： （Nt为对数生长期任一点的理论观察值,N0为对数生长期理论初始值） 计算比较复杂,而我们基于以往曲线进行理论推导而行的理论倍增时间,计算相对简单。,推导过程,结果 曲线一. b=0.855 曲线二. b=0.921,THANK YOU,