最新6007细菌及病毒的遗传作图11-PPT文档.ppt

,内 容,一、病毒的一般特性及类型 二、噬菌体的染色体作图 三、细菌的细胞和染色体结构 四、细菌的染色体作图,第一节 病毒的一般特性及类型,病毒的一般特性 病毒的类型 噬菌体的生活周期,一、病毒的一般特性, 形体极微小，只有在电子显微镜下才能观察到； 化学组成简单，主要是核酸和蛋白质； 只含一种核酸（DNA或RNA）； 无细胞结构，为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒； 缺乏独立代谢能力； 繁殖方式独特，只能依赖宿主活细胞的代谢机器， 通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒 颗粒的方式进行繁殖； 具有双重存在方式，或营专性寄生在活细胞内，或 在细胞外以大分子颗粒状态进行传播； 对干扰素敏感，而对抗生素不敏感,病毒大小,二、病毒的类型,依据宿主范围 植物病毒 动物病毒（人、脊椎动物、昆虫） 微生物病毒（真菌、藻类、原生动物、 细菌、放线菌、蓝细菌） 噬菌体感染细菌和放线菌的病毒。 依据遗传物质：DNA病毒、RNA病毒,微生物病毒噬菌体,噬菌体的特点,个体极小：只能借助电镜才可看见，但在实验时一般用肉眼观察它感染细菌后所形成的噬菌斑加以识别。,专性寄生：在活体外不具任何生命特征，往往一个噬菌体只感染一种细菌。侵染过程： 吸附 遗传物质注入 复制 裂解细菌,无细胞结构：化学组成和繁殖方式简单。,不同结构的噬菌体（或不同的突变型）可同时感染一个细菌，并能在细菌细胞内进行基因重组，即混合感染。,微生物病毒噬菌体,尾管,刺突,T4由头部、颈部、尾部组成,植物病毒,动物病毒,病毒的多样化形态和大小,HIV病毒（反转录病毒）,RNA病毒,刺突tail pins,Phaga, bacterioohaga,95nm,95nm,head,neck,tail（24环）,尾丝(tail fibers),65nm,噬菌体,噬菌体,烈性噬菌体,三、噬菌体的生活周期,当噬菌体感染细菌后，寄主细胞的DNA立即停止活动，由噬菌体的DNA指导合成噬菌体的DNA和蛋白质，产生新的子噬菌体，最后寄主细菌裂解，释放出成熟的子噬菌体，这一类噬菌体称之为烈性噬菌体。通过它对相邻细菌连续不断地侵染和裂解，在长满细菌的不透明的菌落上看到一个圆形的透明区噬菌斑。,噬菌体的增殖包括 吸附 侵入 核酸复制与蛋白质合成 装配 释放,烈性噬菌体的侵染过程,噬菌斑,温和噬菌体,当噬菌体感染细菌后，噬菌体的DNA在宿主细菌体内不立即复制，而只是潜伏宿主细菌体内，与宿主细菌“共存”，并不将主细菌裂解，这一类噬菌体称为温和噬菌体。,温和噬菌体的主要三种繁殖方式：,与烈性噬菌体相似，在宿主细菌体产生很多子代噬菌体，使宿主细菌裂解，这种情况只是偶然或是通过诱导才发生。 当噬菌体的DNA进入宿主细菌体内后，插入到宿主细菌主染色体DNA中，随着宿主细菌主染色体DNA复制而同步复制。与宿主细菌主染色体DNA结合在一起的噬菌体称为原噬菌体，而携带原噬菌体的细菌叫溶源性细菌。 当噬菌体DNA进入宿主细菌体内后，独立于宿细菌DNA之外，以质粒的形式存在于宿主细菌的胞质中。,某些温和噬菌体在侵染细菌后，其DNA整合到 宿主细菌染色体中。这种处于整合状态的噬 菌体DNA称为原噬菌体。 含有原噬菌体的细胞称为溶原性细菌或溶原体。 原噬菌体不进行DNA复制和蛋白质合成，而是随 着宿主细菌染色体的复制而同步复制，并且，随 着宿主细胞分裂而平均分配到两个子细胞中去， 代代相传，这样便进入溶原周期。,型裂解途径,P1型裂解途径,温和噬菌体的生活周期,噬菌体和表型与噬菌体遗传学 基因的细微结构作图 缺失作图 互补测验和顺反测验 负干扰,第二节 噬菌体的染色体作图,一、噬菌体和表型与噬菌体遗传学,寄主范围突变型（h）： 由于基因突变能感染两个品系细菌的突变型，野生为 h， h只能裂解野生型的大肠杆菌，h能裂解野生型及抗 性型的细菌。把两者和大量的野生型和抗性型细菌混合接 种，经培养后就可看到两种噬菌斑，透明的是h，半透明的 是h。,快速溶菌突变型（r）： 由于基因突变能更快复制并裂解细菌的噬菌体突变，野生型为r，由r 于裂解细菌的速度比r快，所以在同一时间内感染同一细菌时， r形成的噬菌斑小，r 形成的噬菌斑大，而且边缘清晰。,条件致死突变型： 在某种条件下可生存，在另一条件下不能生存的突变 型。如温度敏感突变（ts）；在25时能生长，42时不 能生长，色氨酸需要型（c）必须在环境中有色氨酸才能生 存；小噬菌斑型（m）；混浊噬菌斑（tu）等都可依据菌斑 形状鉴别。,两种不同的T2突变体进行杂交,两种不同的T2突变体进行杂交,二、基因的细微结构作图,T4噬菌体的rII系统 r型突变体：快速溶菌突变体（rapid lysis）Benzer选择rII突变体作研究的优点是：与野生型rII+ 相比具有不同的宿主范围。rII不能在E.coli K上生长提供了一种选择手段。,T4 rII 突变体和rII+在E.coil上的表型,T4 E.coil B E.coil K（） rII 大而清晰园 + rII+ 小而模糊 + + 小而模糊,E.coil B能使rII突变体生长，称为rII的许可性宿主（Permisive host），E.coli K（）不能使rII突变体生长，称为rII的非许可性宿主（Nonpermisive host）。,用两种不同的rII突变体感染同一细菌E.coli B，一旦 进入细胞，T4之间的DNA就发生重组，从而产生重组类型的噬菌体。然后感染E.coli K，野生型重组体的数目等于在K上的pfu/ml的数（Plague forming Unit） 优点：用rII系统和两个宿主，不需要筛选大量的噬菌斑就能选择到极少发生的重组体。,用两个不同突变体的噬菌裂解液加到E.coli B株的肉汤培养液中，当二个突变类型的DNA感染同一细菌时可发生杂交。大多数复制的DNA是原来的类型，有时也能重组产生一种双重突变型和正常的重组体（即野生型）。杂交后代植到E.coli B上后，都能良好生长，而植于E.coli K时，只有重组野生型才能生长，双突变体重组型不能生长。,两个不同突变的噬菌体DNA重组的过程,Mix the two phages,Coinfect E.coli B,A,A,r103,r104,Wild type,Double mutant phage,Take some of the phage preparation,dilute it(10-8), and infect E.coli B,Take some of the phage preparation,dilute it(10-3 ), and infect E.coli K,Plate the cells and observe the number of plaques.,Total number of phages,Wild type phages produced by intragenic recombination,两个不同突变的噬菌 体DNA重组的过程,将8个独立而来的rII突变体成对感染E.coli B。形成噬菌斑后再将其裂解液接种感染E.coli K，只有野生型重组体rII 才能生长，而双重组型（rIIrII）不能捡出，也不能生长。因此计算重组体的方法是以野生型的数×2。 公式如下：,基因内重组 Intragenic Recombination,2×rII+ 噬菌体数,总 噬 菌 斑 数,2×在K上生长的噬菌体数,在B上的噬菌斑数,×100%,重组率=,E.coli B,rII ,rII ”,植于E.coli K上选择,T4 rII位点基因内重组的选择。rII不能在K上生长，当二个带有rII不同等位基因的T4感染同一B株后，其某些后代能在K上生长，即已成为rII，结果说明在一个基 因内发生了重组，而不是在基因间。,根据重组率所得基因图： rII1 rII7 rII4 rII5 rII2 rII8 rII3 rII6 _|_|_|_|_|_|_|_|_ 它们的图距就是rII+的重组率,rII基因内重组说明，基因是可以分割重组的，它由更小的单位组成，Benzer称其为重组子recon，重组可以发生在重组子之间，但不能发生在其内部。因此，重组子(而不是基因)是重组的单位，基因是重组子完整的线性顺序，一对核苷酸是重组的最小单位。,缺失作图 deletion mapping,缺 失 区,有一特殊突变体D1，当它分别与带有突变点1、2、3、4、5、6、7或8的突变体杂交时不能获得rII+重组体，那么D1就是缺失18位点的突变体： 9 10 11 12,Benzer利用在rII区域中含有短的缺失的特殊突变体来定位其它新的突变位点。 原理：假定一个由12个突变位点组成的基因图： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,有另一突变体D2，当它与5、6、7、8、9、10、11或12突变位点的突变体杂交时不能获得rII+重组体。即D2就是缺失512的突变体 根据重叠缺失区，可将基因分成三个区域 I II III D1 D2,1 2 3 4,缺 失 区,如何定位新的突变位点 当与D1杂交能获得rII+重组体，与D2杂交却不能， 该突变体的突变位点位于III区； 当与D2杂交时能够，但与D1杂交时不能获得rII+重 组体，该突变位于I区； 与D1和D2杂交都不能得到rII+重组体，其突变位点 位于II区。,在III区里的一个突变体与D1杂交获得rII+的情形,I 和II缺失区,I和II区,D1,新突变体,+,+,+,+,+,III区, , ,突变位点,III区,缺失突变体之间也可以杂交从而象点突变那 样定位，如果杂交得不到rII+重组体，那缺 失区就是重叠的。例如有一缺失图：,1,2,3,利用上述缺失图可将新的突变定位 思考：下图表示T4 rII A顺反子中4个缺失突变体的缺失图 1 2 3 4 现有在rII A中4个点突变体ad，分别试验它们与4种缺失突变体杂交获得rII+的能力，结果如上表。 问：4种点突变的顺序怎样排列？,a b c d 1 + + + + 2 + + + 3 + + 4 + ,三、互补测验和顺反测验,当不能单独在K菌株上生长的两个rII突变体混合感染时，它们能象野生型噬菌体那样在K株上生长，这样两种突变型称为互补的突变型，因为每一种能补偿另一种功能。使两者都能生长。（T4染色体在宿主细胞中暂时二倍化）,噬菌体T4的互补作用,不同的rII突变体可以分成两类：即A组和B组。A组中的所有突变体能与B组中的所有突变体互补，而A组中的某一突变体不能与该组中的另一突变体互补，同样B组中的某一突变体也不能与该组中另一突变体互补。A组中的所有突变体能定位到rII区段的一边，B组中的所有突变体能定位到rII区段的另一边上,A组 B组,A互补群,B互补群,混合感染,rII突变体,rII突变体,E .coli k(),互补作用 无互补作用 细胞裂解释放 细胞不裂解无子 出子代噬菌体 代噬菌体释放,rII互补作用图解：两个不同的突变体rII和rII同时感染E.coli K，一般情况下，rII突变体不会裂解K产生子代噬菌体；然而当两个rII能互补时，就会裂解并有噬菌体生长，如果两个突变体不能互补，就不会裂解，也不会有噬菌体生长。,rII突变体互补的解释： rIIA rIIB rII1 （1） （2） 裂解 有两个基因rIIA和rIIB在细菌裂解中起作用，裂解的两个步骤分别由rIIA基因产生的酶A和rIIB基因产生的酶B控制。两个rII突变体分别在rIIA或rIIB区域缺陷,+,rIIA,rIIB,+,rII,酶A,酶B,由于rII1和rII2的染色体各自能产生裂解途径中所必需的一种酶,所以裂解就能发生,即有野生型表型出现，称这两个rII突变体能互补 与二倍体植物细胞染色体互补作用相类似，T4噬菌体的混合感染使噬菌体染色体处于暂时的“二倍体”细胞状况，在这过程中发生了互补作用。,顺反子（Cistron）,不能互补的突变必然影响的是同一功能单位，能够互补的突变必定影响不同的功能单位，通过顺反试验发现的遗传功能单位称为顺反子。rII区段中包括两个作用单位A和B。也就是两个顺反子。,顺反子的概念来自顺反试验：它是用于说明在同一染色体上（顺式）或相对染色体上（反式）排列的突变位点之间的互补试验。顺式试验实际是对照，反式试验才是真正的互补试验。如果反式排列时有互补作用，说明两个突变位点处于不同的顺反子中，如不能互补，说明它们属于同一顺反子。,顺式试验,反式试验,突变位点位于同一顺反子中,突变位点于不同顺反子中,A,B,A,B,A,B,A,B,+ ,+ +,一个顺反子是一段遗传区域，在这一遗传区域中的突变位点之间没有互补作用。例如两个不同的rII突变体（反式结构）感染同一细菌，而噬菌体不能生长，那么这两个突变位于同一顺反子中（右上）；如果有互补作用，即后代噬菌体能生长，那么这两个突变体位于不同的顺反子中（右下），在右上图中，只有顺反子B的功能正常，而在右下图中，A、B两个顺反子的功能都正常。,Benzer 顺反子概念和基因内重组 Discovery of Recombination Within the Gene,Benzer 以T4噬菌体为材料进行了研究工作 ，正式提出“顺反子”这个术语,Benzer 顺反子概念和基因内重组 Discovery of Recombination Within the Gene,Benzer将两个rIIA突变型对B株进行混合感染，再让释放的子代噬菌体感染K株。 出现了野生型噬菌体。,四、负干扰,在噬菌体的三点测验中，发现一个单 交换发生后，会增加另一个单交换发生 的概率即所谓负干扰现象，这时干扰系 数为负值，或符合系数大于1 负干扰系数后来在真核生物如家蚕、真 菌中也有发现，负干扰的发生可能与基 因转变有关，往往重组基因相距很近或 发生基因内重组时会出现负干扰,第三节 细菌的细胞和染色体结构,细菌细胞 细菌染色体 细菌遗传研究的方法 细菌的突变型,一、细菌细胞 大小：1-2 m； 繁殖方式：二裂式均等分裂，1代/20min。,大肠杆菌 E.coli,细菌的基本形态,细菌的结构模式图,二、细菌染色体 结构:环状双链DNA，单倍性，以折叠或螺旋状态存在； 大小：长约250-35000m(未螺旋)； 复制方式：着膜式复制。 分裂特点：均等分裂，无基因重组。,E.Coli 的拟核,三、细菌遗传研究的方法,基本培养基（minimal medium） 完全培养基（complete medium）,细菌的平板培养,细菌的稀释培养及菌落,影印培养法,四、细菌的突变型,合成代谢功能的突变型:（营养缺陷型） 分解代谢功能的突变型： 抗药性突变型: 青霉素: penr, pens 链霉素: strr, strs,penicillin Streptomycin 抗性: resistance 敏感: sensitive,抗噬菌体突变型 T1噬菌体 Tonr Tons T2噬菌体 Ttor Ttos,突变型的筛选,例如： 营养缺陷型的筛选: u.v 野生型细菌 完全培养基： 影印培养 基本培养基： 补充培养基 ： 氨基酸类 维生素类 系列氨基酸 补充培养基：赖氨酸 脯氨酸 精氨酸.,接合 转化 性导 转导与细菌染色体作图,第四节 细菌的染色体作图,一、接合,接合现象的发现,1946年Lederberg和Tatum用E.coli K12品系中两个菌株A和B做了一个 杂交实验首先证明了E.coli的有性生殖和基因重组。,A：methiothrleuthi 甲硫氨酸、生物素、 B：methiothrleuthi 苏氨酸、色氨酸、硫胺素,A与B在基本培养基上都不能生长，A+B混合培养在完全培养基上过夜，然后把混合物离心、洗去培养基，涂布在基本培养基上，长出了菌落，是野生型。,黎德伯格和塔特姆的接合(杂交),推测 有四 种可 能：,1、营养上的互补,2、A与B发生杂交,3、一个菌株的突变型基因发生了回复突变,4、细菌细胞没有接合，而是交换了DNA,1950年，Davis设计了U形管代谢产物互补实验，证明了A与B是通过接合传递遗传物质的。细菌之间通过杂交，发生了基因的重组和交换。,说明什么?,Met+bio+thr+leu+,在任何一臂内都没有出现原养型细菌。这说明两个菌株间的直接接触-接合，是原养型细胞出现的必要条件。,Hayes（1952)试验证明，在接合过程中遗传物质的交换是一种单向的转移： 供体（雄性） 受体（雌性）,Heyes实验,methiothrleuthi × methiothrleuthi,A菌株,B菌株,基本培养基上有菌落出现,（2）链霉素处理A再与B杂交，在基本培养基上有菌落出现,（3）链霉素处理B再与A杂交，在基本培养基上无菌落出现。,说明：遗传物质在大肠杆菌中的传递不是相互的，在这里，A为供体可将遗传物质传递给B（受体），B不能将遗传物质传递给A。后来发现，供体与受体间性行为的不同，是由一个微小的可转移的质粒F因子引起的。,（1）,两个E.Coli 细胞杂交的电子显微镜照片(X 34,300),性伞毛/接合管,性伞毛/接合管,F因子及F+/Hfr向F的转移,Hayes和Cavalli-Sforza（1953)发现，供体有一个性因子即致育因子-F因子，由DNA组成，是染色体外的遗传物质。其组成：,F 因子：致育因子（性因子） 携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F表示。 未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F表示。 F 因子的组成： 复制区 (含2个复制起点oriT,oriV)； 致育基因区； 配对区（含有4个IS）,E.coliF因子存在状态有三种类型： 没有F因子，即F 游离状态的F因子，即F+ 整合的F因子，即Hfr,F因子的转移,F+×F-的特点,F因子转移的频率高，1/10，使F-F+。 染色体重组频率低；10-6 。 F+×F+不发生接合。 因此，F+品系又称为低频重组品系 (low frequency recombination，Lfr)。,F+×F-,F+ F+,F- F+,高频重组 (Hfr),Hfr的形成及转移过程 由F因子和细菌染色体的单交换产生； 转移时带有供体细菌的染色体。,Hfr的特点 ： 染色体重组频率高，比 F+×F- 高1000倍； F因子转移频率低， F-F+ 很少或没有。 Hfr和F+的联系和区别 联系： 都是雄性菌，含有F质粒 区别： 前者高频重组，后者低频重组； 前者F因子转移频率低，后者F因子转移频率高； 前者F因子整合，后者F因子游离。,中断杂交实验绘图,为了证明接合时遗传物质从供体到受体细胞的转移是直线式进行的，Jacob和Wollman在五十年代设计了一个著名的中断杂交试验,1961年 Jacob 和 Wollman 供体HfrH ：strs thrleuazir tonr lac gal 受体F ：strr thrleuazis tons lacgal 操作方法：37混合培养 每隔一段时间取样 搅拌器中断杂交 涂布含链霉素的基本筛选培养基 影印培养于含链霉素的几种不同的培养基（选择培养基）上 观察重组子 鉴定各基因的转移时间,HfrH菌株各非选择标记基因进入F细菌的时间和频率,以基因出现的时间为标准，作出E. coli的遗传连锁图,用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序,结论：不同Hfr菌株向F细胞转移的顺序、起点和方向不同。表明大肠杆菌的染色体是环状的。,大肠杆菌的环状染色图,细菌重组的特点： 基因重组发生在部分二倍体中； 只有偶数次交换才能产生平衡的重组子； 在选择培养基上只出现一种重组子，而没 有相反的重组子。,例如：根据中断杂交试验已知 lac 和 ade 基因是紧密连锁的，而且 lac 比 ade 先进入受体。,未重组的基因型是lac+ade+ 重组体的基因型是lac-ade+,lac-ade间的距离：,转化：某些细菌(或其他生物)通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程,二、转化,转化的类型 自然转化（natural transformation） 细菌能够自然地吸收DNA，如枯草杆菌的转化。 工程转化（engineered transformation） 通过某种处理使细菌能够摄入外源DNA，如大肠杆菌 的转化。 转化效率：约1 转化片段的长度：20kb,细菌转化过程示意图,转化在基因定位中的应用,判断两个基因的位置关系 观察DNA浓度降低时AB基因共转化频率的下降和A、B各自转化频率下降的程度： 程度相同表明 ；共转化频率下降的程度远大于各自转化频率下降的程度，表明 。 观察转化频率： AB共转化频率与A、B各自转化的频率相近，表明 ；相差很远，表明 。 基因作图：判断基因间的距离,连锁,不连锁,连锁,不连锁,计算重组值,遗传作图,三、性导,F因子：从Hfr染色体上不精确分离产生的含有细菌基因组的 新的F因子。 性导：利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体 的过程。内基因子和外基因子,雅科和阿代尔伯格发现：特殊的Hfr菌株能把lac+ 等位基因高频率地转移到Flac-受体中,lac基因位于远端，中断杂交实验中只有1/1000重组率,由F'携带lac+ 基因进入受体后可在lac位点上形成部分二倍体F'lac+ / lac-,四、转导与细菌染色体作图,转导：指以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程 Lederberg和Zinder（1951)首先在鼠伤寒沙门氏菌中发现转导现象 phetrptryr × methis 在基本培养基上发现原养型的菌落 可能性：（1）接合 （2）转化 （3） ？,转导类型： 普遍性转导：通过噬菌体可以转移细菌染色体上的任何基因，如P22，P1。 局限性转导：噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分，如噬菌体。,U型管试验 将上述两种菌株分别放在戴维斯U型管 的两臂内，中间用玻璃滤板隔开，以 防止细胞直接接触，但允许比细菌小的物质通过，获得了野生型重组体，说明不是接合,普遍性转导的过程,普遍性转导作图, 原理： 如果两个基因始终一起转导或同时转导频率较高，那么表明这两个基因是连锁的； 两个基因同时转导的现象称为共转导或并发转导（contransduction）； 两基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密；相反，共转导频率愈低，则表明两个基因距离愈远。,判断细菌基因间的位置关系 以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu、thr、azi三个基因的顺序。 供体 thr+ leu+ azir 受体thr- leu- azis，观察其共转导率。,三个基因间的排列顺序, 重组值的计算 a+b+供体 ab受体,局限性转导,(1)产生机制,(2)低频转导 由于不正常环化现象发生的频率较低，在释放出的106个噬菌体中只有1个gal转导噬菌体感染受体，因此转导的频率很低，称为低频转导。 dgal gal受体 稳定转导子 不稳定：整合切离,(3)高频转导(high frequency trasduction，HFT) 由于产生/dgal双重溶源菌，使溶菌物中既含有大量的dgal，又包含正常的噬菌体，正常的起了辅助缺陷型噬菌体成熟的作用，所以称为辅助噬菌体，从而导致高频转导。,1、为什么不少生物学家认为病毒不是生物？为什么病毒在遗传学研究中具有重要作用？ 2、名词解释：着丝粒作图、质粒、F因子、F+菌株、F-菌株、Hfr菌株、性导、列性噬菌体、温和噬菌体、原噬菌体、溶源性细菌、转导、普遍性转导、局限性转导,复习题7,