最新第三章:酶工程动植物细胞培养产酶-PPT文档.ppt
植物细胞结构,植物、动物、微生物细胞的特性比较,三者之间的差异主要有: 植物细胞动物细胞微生物细胞。 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,一、植物细胞培养产酶 从外植体中选育植物细胞高产稳定细胞培养各种产物 1.植物细胞培养的特点 提高产率和产品质量 缩短周期 易于管理,2.培养基特点 需要大量无机盐 需多种维生素和激素 氮源一般为无机氮 一般以蔗糖为碳源 应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。P82表3-3,3.培养工艺:悬浮细胞培养 工艺流程 外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物 外植体选择和处理 选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株,把茎、叶、根、芽,花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇,0.1%升汞消毒,无菌水漂洗。,外植体: 从植株取出,经过预处理后,用于植物组织培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等)的片段或小块。 愈伤组织: 将上述外植体植入诱导培养基中,于25左右培养一段时间,从外植体的切口部位长出小细胞团。,水稻的外植体(幼胚)和愈伤组织,外植体,愈伤组织,植物细胞获取 直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法 细胞悬浮培养:转新培养基,在生物反应器中进行培养 分离纯化:生化技术,机械法,酶法, 培养条件的影响与控制 温度:室温25 pH:微酸性范围。即pH 5.0-6.0 通气与搅拌 光照的控制:强度和时间有一定要求 前体的添加(饲喂) 刺激剂的应用,4.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶(SOD)为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣,去除外皮,先用70%乙醇消毒20s,再用0.1%升汞消毒10min,然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下,切成0.5cm3的小块,植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中,在25,600lux,12h/d光照条件下培养18d,诱导得到愈伤组织,每18天继代一次。,(2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织,在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA (苄基腺嘌呤) 的液体MS培养基中,加入灭菌的玻璃珠,25,600lux,12h/d光照条件下震荡培养18d,使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下,经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中,25,600lux,12h/d光照条件下震荡培养18d。,(3)酶的分离纯化 细胞培养完成后,收集细胞,经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,二、动物细胞培养产酶 1.动物细胞培养的特点 动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 需添加抗生素(常用青霉素和链霉素联合) 细胞生长速度慢 细胞体积大,无细胞壁保护,对剪切力敏感。 反应过程成本高,产品价格贵 细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养 原代细胞一般繁殖50代,2.培养方式 (1)悬浮培养 (2)贴壁培养 滚瓶培养 微载体培养(microcarrier culture) (3)固定化细胞培养 包埋(entrapment)和中空纤维(microencapsulation)培养,3.工艺控制 工艺流程 种质细胞 (体细胞;杂交瘤细胞) 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养 收集 分离纯化 产物,胰蛋白酶消化,培养条件的影响与控制 温度:一般控制在36.5. pH值:一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 溶解氧:根据情况随时调节。,4.产酶实例 以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例 纤溶酶原 纤溶酶,纤溶酶原激活剂,种质细胞用胰蛋白酶处理,分散,pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 接种到反应器中,与37 CO2培养箱中,长成致密单层 去培养液,用pH7.4磷酸盐冲洗细胞 换无血清Eagle培养液,继续培养 每3-4天,取出培养液分离纯化 再加新鲜Eagle培养液,继续培养 亲和层析进行分离,细胞生产滚瓶培养装置,第一章 作业:,1.概念 酶活力单位 酶比活力 2.酶工程的主要任务和主要内容是什么? 3.写出酶活力测定的一般步骤。,第二章 作业:,1.概念:产物阻遏;分解代谢物阻遏;酶合成的诱导 2.提高酶产量的策措施有哪些? 3.试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依据。 4.影响酶生物合成模式的主要因素是什么? 5.优良产酶菌种应具备哪些条件?,第三章 作业:,1.概念:外植体;愈伤组织;微载体培养 2.论述植物细胞培养产酶的条件控制。 3.动物细胞培养的特点有哪些? 4.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。,