[党团建设]多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

温故知新1:,组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? DNA分子结构有什么特点？,脱氧核苷酸链结构简图,磷酸二酯键,5,5,3,3,DNA分子的复制过程是怎样的？ DNA分子的复制需要哪些条件？,温故知新2,DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA),DNA复制的条件,1、 PCR（多聚酶链式反应）技术：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。 2、原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。,一、基础知识 （一）PCR原理：,DNA母链：提供复制的模板 解旋酶： 打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶： 催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连 接脱氧核苷酸(一小段RNA),3、PCR反应的条件,80100：,耐热的DNA聚合酶：,缓冲溶液：维持反应的pH值不变,(一般是一小段单链DNA),(二)PCR反应的过程,1、变性：,温度上升到90以上时,双链DNA解聚成为单链。,2、复性（退火）：,温度下降到50左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。,3、延伸：,温度上升到72左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在Taq DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。,PCR 循环第一步 ：加热变性: 双链DNA解聚成为单链,PCR 循环第二步 ：引物与靶序列复性（退火）: 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,PCR 循环第三步 ：引物延伸: 合成新的DNA链,靶序列,靶序列,第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列,30次循环后靶序列扩增的数量,4、PCR 循环的结果, DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。,二、 实验操作,1、PCR仪,（一）设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器。,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,PCR仪,1、准备,2、移液,（二）实验操作步骤,按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上,用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂,过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。,注意：,3、混合,B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。,A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。,将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。,4、离心,5、反应,离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。,PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：,6、注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。,（一）理论上DNA扩增数目的计算,三、课题成果评价,1 、一条DNA，复制n次， DNA为：2n,2 、 a条DNA，复制n次， DNA为：a2n,（二）实验中DNA含量的测定,1 、原理,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。,2 、过程,稀释,2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。,取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。,计算,计算,DNA含量（ g ） 50 x（260nm的读数）x稀释倍数,公式中50的含义：50g /ml的DNA在标准厚度为1cm比色杯中的吸光值为1。,比色杯,四、 课题延伸,例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异性强、敏感性高、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点。,