课题2__多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

多聚酶链式反应(PCR技术)， 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段,1、DNA分子的组成成分和结构,DNA 分子的基本组成单位是 .共有 种,每个基本单位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 构成。,脱氧核甘酸,4,磷酸,碱基,脱氧核糖,？,那么DNA分子的平面结构怎样呢？,二 、基础知识,A,G,C,T,1、DNA的基本单位脱氧核苷酸,2、DNA分子的平面结构,5'端,3'端,识别 ： DNA分子的3 端与5 端 -OH端为3 ; 磷酸基团的末端为5。,2、DNA分子复制的过程,解旋酶,DNA母链,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物（ RNA）,打开DNA双链,模板,合成子链原料,催化子链合成,使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸,思考：体内DNA复制的条件是什么？ 体外扩增DNA 如何提供相似环境？,变性（ 80-100 ）,Taq聚合酶（耐高温）,2030个核苷酸构成DNA或RNA,DNA双链,单链,变性（加热80-100 ）,复性（缓慢冷却）,4、DNA 分子的热变性原理：,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物和引物与两条单链的结合,一、PCR的原理（ PCR的技术原理）,时间（min）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复13步30轮,3、DNA复制的方向,DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,2、步骤：变性 复性延伸,PCR技术的原理总结,利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。,体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。,复制的方向：子链的5端向 3端延伸。,二、PCR的反应过程,变性95oC,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,2530 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。,每个循环包括：变性 复性延伸,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,PCR的反应过程总结,三、 PCR反应的实验操作,1、PCR仪,设备及用具,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上一台能够自动调控温度的仪器,三、 PCR反应的实验操作,（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）,四、结果分析与评价,DNA 含量的测定：稀释对照调零 测定计算（公式见P63）,波长260nm处读数,蒸馏水做对照,50倍,（一）理论上DNA扩增数目的计算,四、课题成果评价,1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n,2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n,（二）实验中DNA含量的测定,1 、原理,可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关,2 、过程,稀释,2µL PCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值,测定并计算,DNA含量（g/mL）50×(260nm的读数)×稀释倍数,50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50g /ml的,体内DNA复制与PCR的技术区别：,课堂小结,练习巩固,1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定 B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学 C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案 D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？,3、PCR技术最突出的优点是 A 原理简单 B 原料易找 C TaqDNA聚合酶有耐热性 D 快速、高效、灵活、易于操作,从子链的5端向3端延伸,4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A 反复洗涤 B 不怕外源DNA污染 C 高压灭菌 D 在20 储存,