超级耐药菌NDM-研究进展与对策.ppt
超级耐药菌NDM-1 研究进展与对策,解放军总医院 王睿 wangrui301vip.sina.com,超级细菌（ Superbugs ） PDR,Superbugs:are super-bacteria that are resistant to almost all antibiotics。,MRSA、VRE、VRSA 碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌 碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌 碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（KPC、 IMP、NDM-1) 碳青霉烯耐药其它肠杆菌科细菌 。,（是指对其治疗药物几乎均耐药的细菌）,主要超级细菌菌种：,IDSAs 2004 Report: “Bad Bugs, No Drugs (BBND): As Antibiotic Discovery Stagnates, A Public Health Crisis Brews”,当前关注的耐药问题,革兰阳性菌： MRSA，MRSE, MRCNS VRSA VRE PRSP 革兰阴性菌： 多重耐药的铜绿假单胞菌 泛耐药不动杆菌属 嗜麦芽窄食单胞菌 产ESBL、AmpC酶的肠杆菌科细菌 产NDM1酶的肠杆菌科细菌,感染性疾病严重危害人类健康,Peleg A, Hooper D. New Engl J Med. 2010;362:1804-13,Loss of Porins Antibiotic Modifying Enzymes Lactamases Target Site Modification Transmembrane Efflux Pumps Ribosomal Mutations Metabolic bypass Mechanisms Mutations of the lipopolysaccharide,G-菌耐药机制,我国10年前的碳青霉烯类耐药,到目前为止产碳青霉烯酶的菌株的发生率排序： -不动杆菌铜绿假单胞菌肠杆菌科菌（1%-2%）,-lactamases,碳青霉烯酶,ESBL,B类金属酶,A类酶丝氨酸,D类,GIM,VIM*,KHM,AmpC,超广谱-内酰胺酶,OXA,KPC,IMI,GES,NMC,SME,B类金属酶,A类酶丝氨酸,IMP,VIM,SPM,NDM-1,SIM,AIM,DIM,目前备受关注的NDM-1,2008年，第一例，瑞典， 由印度归国者,从印巴传出？,检出NDM-1的国家,最早报道第一例产NDM-1细菌,最早报道的产NDM-1细菌为肺炎克雷伯菌，于2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现。 对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对粘菌素敏感。 深入研究发现这株细菌携带一种新型金属-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点命名这种酶为NDM-1，其后还在这名患者粪便中分离到产NDM-1的大肠埃希菌。,D Yong,M Toleman,C G iske, H Cho ,K Sundman,K,Lee,and T Walsh* Walsh T研究组宣布:第一例瑞典患者从印度携带NDM-1金属酶-泛耐药-肺炎克雷伯菌的遗传特征 Antimicrob.Agents Chemother.2009 Dec,53:5046,Characterization of a New Metallo-Lactamase Gene ,bla NDM-1,and a Novel Erythromycin Esterase Gene Carried on a Unique Genetic Structure in Klebsiella pneumoniae Sequence Type 14 from India,NDM-1已有报道的国家,Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study,Karthikeyan K Kumarasamy, Mark A Toleman, Timothy R Walsh, Jay Bagaria, Fah ana Butt, Ravikumar Balakrishnan, Uma Chaudhary, Michel Doumith, Christian G Giske, Seema Irfan, Padma Krishnan, Anil V Kumar, Sunil Maharjan, Shazad Mushtaq, Tabassum Noorie, David L Paterson, Andrew Pearson, Claire Perry, Rachel Pike, Bhargavi Rao, Ujjwayini Ray, Jayanta B Sarma, Madhu Sharma, Elizabeth Sheridan, Mandayam A Thirunarayan, Jane Turton, Supriya Upadhyay, Marina Warner, William Welfare, David M Livermore, Neil Woodford 31名专家（英，印，巴，荷兰，瑞典，澳）多国联合发表文章-产NDM-1菌株,Lancet Infect Dis 2010;10: 597602,NDM-1流行现状,英国、印度等国研究人员在印度、巴基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-1肠杆菌科细菌占所检测细菌的1.2%-13% 主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其它细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等 这些细菌主要引起尿路、血流、伤口、肺部和导管相关感染等。 在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我国香港地区等都已经有感染病例报道。,产NDM-1细菌感染的易感人群：疾病危重、入住重症监护室、长期使用抗菌药物、插管、机械通气等。 产NDM-1细菌感染患者临床表现与敏感菌感染没有差别。 主要感染类型包括泌尿道感染、伤口感染、医院获得性肺炎、呼吸机相关肺炎、血流感染、导管相关感染等。 感染患者碳青霉烯类治疗无效，需要考虑产NDM-1细菌感染可能，及时采集临床样本进行细菌检测,调查菌数-180 -印度南方， 44，为克隆株，质粒结合 -印度北方， 26，散发，不能质粒结合 -英国， 37，散发，质粒结合 -印度、 孟买 73， 调查细菌 -大肠杆菌 36， -肺炎克雷伯菌克 111， -其他菌 特点 -泛耐药，有NDM-1金属酶 -英国的17人去过南亚，多为医疗旅行,Kumarasamy KK,et al. Lancet Infect Dis, 2010;10:597602,Kumarasamy KK,et al. Lancet Infect Dis, 2010;10:597602,Kumarasamy KK,et al. Lancet Infect Dis, 2010;10:597602,Kumarasamy KK,et al. Lancet Infect Dis, 2010;10:597602,Kumarasamy KK,et al. Lancet Infect Dis, 2010;10:597602,NDN1文献分类,57篇文献，其中综述5篇，会议文章9篇 病例报告类文章22篇，论著21篇。 研究方法均为临床病例分析和相应的实验室研究， 体外研究包括细菌敏感性、NDM-1酶功能的检测、分子生物学及DNA测序 临床研究包括病例报告与分析。,NDM1文献发表年份,Figure 1Distribution of published time of NDM-1 literatures,NDM1文献发表杂志,发文NDM12篇以上的国家,相关国家或地区文献报告病例数及检出细菌种类,. 相关国家或地区文献病例数及检出细菌种类,NDM-1超级病菌-个例,NDM-1,法国、英国、美国、加拿大、比利时、澳大利亚、荷兰、日本、香港都有 目前170人被感染 香港去年十月，-66岁的印度男患者的尿液测出NDM1大肠杆菌，痊愈出院 法新社，比利时布鲁塞尔一个医生说，一男子曾在巴基斯坦出车祸，又回比接受短暂粘菌素治疗，今年6月死亡。按法新社说法，他是NDM1致死第一人？,日本第一例产NDM1大肠埃希菌,日本独协医大医院的一名男性患者身上分离出的大肠埃希菌被确认是日本国内首例NDM1超级细菌。 日本新潟大学研究生院教授山本达男日前通过电子显微镜成功拍摄到了“超级”大肠埃希菌的照片。该细菌拥有“NDM1”基因，对大多数抗生素具有耐药性。山本表示，这应该是全球首次成功拍摄到NDM1超级细菌照片 该细菌长约2微米。超级细菌的鞭毛更多，更具灵活性，感染能力也更强。表面覆有一层可抵御白血球攻击的膜，,Antimicrop.Agents Chemother.published ahead of print on 7 September 2010,doi:10.1128/AAc.00878-10,Emergence of metallo-ß-lactamase NDM-1-producing-multidrug resistant Escherichia coli in Australia(澳洲) 多重耐药大肠埃希菌 水解碳青霉烯 含NDM-1基因金属酶 还具有ESBL-CTX-M-15基因 两个16S RNA 甲基化酶（ArmA、RmtB）高耐氨基糖苷类,澳大利亚第一株NDM-1大肠埃希菌,NDM-1很有可能传播,NDM-1为质粒介导，很容易传到其他细菌，已经证实。 “医疗旅行”及商务旅行，旅游可加速耐药基因的传播。 NDM-1存在于大肠埃希菌、肺克中。 下列情况促使耐药基因传播： -卫生条件低下 -人口过多 -湿热气候 -抗菌药物的广泛，和过量使用,NDM-1的检定,碳青霉烯类不敏感菌 纸片法 PCR 改良HODGE 荧光PCR EDTA E Ttest条 分子流行病学 EDTA 纸片协同法 耐药机制和感控,NDM-1 的检测方法,NDM-1，即新德里金属-内酰胺酶-1型，是由细菌质粒上携带的blaNDM-1基因编码的。目前，国际上已有五十余篇关于NDM-1的研究性文章或相关部门报告发表。 由blaNDM-1编码产生的碳青霉烯酶及因此产生的对碳青霉烯类耐药性可以通过现有推荐使用的表型鉴定方法准确、可靠的鉴定出来,1 US CDC. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2010 Jun 25;59(24):750. 2 Yong D et al. Antimicrob Agents Chemother. 2009 Dec;53(12):5046-54.,CLSI M100-S20及CLSI M100-S20-U碳青霉烯类折点 2010年,表型筛查试验,纸片扩散法： 美罗培南（10ug）或亚胺培南（10ug）： 抑菌圈直径22mm 肉汤稀释法或Etest法 美罗培南或亚胺培南:MIC2ug/ml 亚胺培南适合于大肠埃希菌，克雷伯菌属，沙门菌属，肠杆菌属 变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属对亚胺培南敏感性下降是由产碳青霉烯酶外的其他机制引起，因此对这些菌株尚未建立用亚胺培南MIC法进行筛选和确认碳青霉烯酶，并且亚胺培南纸片法对所有肠杆菌科碳青霉烯酶的筛查效果都不好,1 Yong D et al. Antimicrob Agents Chemother. 2009 Dec;53(12):5046-54. 2 Kumarasamy KK et al. Lancet Infect Dis. 2010 Sep;10(9):597-602.,表型确认实验,双纸片协同试验:采用亚胺培南(10g)、EDTA（1500g） 两种纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。 采用亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值5mm 亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合E试条协同试验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值8，即可判定产金属酶。,表型确证试验,纸片扩散法： Etest法： 双纸片协同法： 改良霍奇试验(modified Hodge test) 自动化鉴定与药敏仪器,1 Yong D et al. Antimicrob Agents Chemother. 2009 Dec;53(12):5046-54. 2 Kumarasamy KK et al. Lancet Infect Dis. 2010 Sep;10(9):597-602.,表型确证试验,纸片扩散法：亚胺培南(10ug)/亚胺培南(10ug)+ EDTA(1500mM 10ul)复合纸片 结果判读：复合纸片比单药纸片抑菌环直径增大5mm,图：复合纸片法判定金属-内酰胺酶示意图 (左纸片：亚胺培南/EDTA, 右纸片：亚胺培南),1 Yong D et al. J Clin Microbiol. 2002 Oct;40(10):3798-801.,表型确证试验,Etest法：,Etest® MBL (IP/IPI、MP/MPI) 结果判读：单药与复合制剂的MIC比值8,图：Etest MBL (IP/IPI),1 http:/www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinical-diagnostics/dynPage?doc=CNL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_60,图：Etest MBL 试验示意图 (亚胺培南/亚胺培南+抑制剂EDTA),1 Lee K et al. J Clin Microbiol. 2005 Feb;43(2):942-4.,表型确证试验,双纸片协同法：,亚胺培南(10ug)、EDTA(0.5M x 10 l约0.5mg/片)， 间距10mm (0.5McF）,图：亚胺培南-EDTA双纸片协同试验示意图 (图中菌种为铜绿假单胞菌),1 Lee K et al. J Clin Microbiol. J Clin Microbiol. 2003 Oct;41(10):4623-9.,E. coli ATCC 25922,厄他培南抑制 E. coli ATCC 25922,有丰富菌的E. coli ATCC 25922生长,#1 pos,制备 0.5McF的 E. coli ATCC 25922菌悬液. 1:10稀释 用棉签均匀涂布 MHA 平皿、约5分钟，中心贴厄他培南或美罗培南纸片 用1 ul接种环挑取2-3个实验菌菌落，从纸片边缘向外划线 过夜培养（16-20h）. 出现向内生长的菌株示碳青霉烯酶阳性（如图1，2）.,表型确证试验,#2 pos,#3 neg,CLSI M100-S20.,改良霍奇试验(modified Hodge test),blaNDM-1基因检测（荧光定量PCR法） （该方法待标准菌以确认）,提取质粒DNA及基因组DNA 配制PCR反应液（含特异性引物及探针） 加入步骤3提取的模板DNA进行扩增 测定样本DNA的扩增Ct值，小于特定Ct值的判为阳性。,阴性、阳性对照品进行DNA提取 配制PCR反应液（含特异性引物及探针） 阴性、阳性对照品DNA进行扩增 阴性及阳性对照品检测结果应符合质量标准,PCR测NDM-1的引物,第一对引物： 5-CAGCACACTTCCTATCTC-3 5-CCGCAACCATCCCCTCTT-3 第二对引物： 5-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3 5-CGCAACACAGCCTGACTTTC-3 也可以自己设计引物，还可以实际金属酶的通用引物,Bla NDM-1基因检测（荧光定量PCR法）,提取质粒DNA及基因组DNA（包括阴性、阳性对照品） 配制PCR反应液（含特异性引物及探针） 加入提取的模板DNA进行扩增（包括阴性、阳性对照品） 测定样本DNA的扩增Ct值，小于特定Ct值的判为阳性。 阴性及阳性对照品检测结果应符合质量标准,NDM1有效药物,1.替加环素（tigecycline）:四环素类衍生物，超广谱抗菌药物，对产NDM-1细菌MIC90值为2-8mg/L，敏感率56%-67%。治疗产碳青霉烯酶细菌感染有一定疗效。 2.多粘菌素（polymyxins）:属多肽类抗菌药物，包括多粘菌素B和粘菌素两种。粘菌素对产NDM-1细菌MIC90为2-32mg/L，敏感率89%-100%。小样本研究提示单用治疗效果差，需和其它药物联用，要静脉注射给药，肾毒性明显。 3.碳青霉烯类：产NDM-1细菌对碳青霉烯类耐药，体外MIC值差异较大，对MIC值低（4mg/L）的菌株感染有一定疗效，需和其它药物联用 4.氨基糖苷类：不同药物间呈部分交叉耐药，我国临床分离的产金属-内酰胺酶肠杆菌科细菌对阿米卡星、异帕米星具有一定敏感性。对轻、中度感染可以单用，重度感染需要与其它药物联合应用。用药期间注意药物耳肾毒性。,NDM1有效药物,5.氟喹诺酮类：需要根据药物敏感性测定结果选择药物。 6.磷霉素：体外研究表明对部分耐药菌有效，但缺乏临床研究数据。 7、联合方案： 如替加环素联合多粘菌素 替加环素联合磷霉素 替加环素联合氨基糖苷类 碳青霉烯类联合氨基糖苷类 碳青霉烯类联合多粘菌素 喹诺酮类联合碳青霉烯类等,产NDM-1细菌感染预防,1.在进行各种侵袭性操作中，严格执行无菌操作。 2.严格执行医务人员手卫生规范（WS/T313-2009）：医疗机构必须提供充足的手卫生设施。医务人员在接触病人前后、进行侵入性操作前、接触病人使用的物品或处理其分泌物、排泄物后，必须洗手或用含醇类速干手消毒剂擦手。 3.加强对重点部门尤其是ICU物体表面的清洁、消毒。对生命监护仪、微量输液泵、呼吸机等医疗器械的面板或旋钮表面、计算机键盘和鼠标、电话机、病人床栏杆和床头桌等，采用适宜的消毒剂，每天必须仔细擦拭、消毒，疑似或确认有产NDM-1细菌感染或带菌者，所处病室需增加消毒次数。 4.隔离确诊产NDM-1细菌感染或定植者，预防耐药菌传播。将病人安置单独房间，接触患者时需要穿隔离衣、戴手套，相关医疗器械或物品如听诊器、血压计等专用，不能专用需用后严格消毒。隔离期间需要定期检测耐药菌情况。,谢 谢！,
