浙江大学生物化学甲实验课件实验9氨基移换反应及其产物的鉴定.ppt
实验九,氨基移换反应及其产物的鉴定,丁鸣,一、实验目的和要求 1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理； 2、学习纸层析的原理和操作技术。,二、实验基本原理 1.氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH接近7.4，在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性最强。 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase, GPT）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性较高。,GPT催化下的转氨基反应为：,L谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L谷氨酸氧化脱NH2，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L谷氨酸。 本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。,2. 纸层析原理： 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分离。,溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：,X原点到层析斑点中心距离 Y原点到溶剂前沿的距离,在一定的条件下某种物质的Rf 值是常数。Rf值的大小与样品的性质、结构、溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的pH）、层析的温度和层析滤纸有关。此外，样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。,用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的R基团的化学结构或极性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（ 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸样品的分离图谱。,3. 茚三酮的显色原理： 氨基酸+茚三酮类 紫红色复合物,80,三、实验材料与试剂 1、实验材料 动物肝脏(牛蛙肝或猪肝） 2、实验试剂 0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）； 0.1mol/L丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）； 0.1mol/L酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）； 0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）； 展层溶剂酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）； 10三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； 0.25%碘乙酸（抑制L谷氨酸脱氢酶活性）； 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。,四、实验器材与仪器 研钵； 试管及试管架； 恒温水浴箱（37、100）； 铅笔、尺和圆规； 毛细管（直径0.5mm)； 新华定性滤纸（直径11cm）； 剪刀和镊子； 电吹风； 滴管； 康氏皿； 喷雾器； 烘箱（80 ）。,五、实验操作方法和步骤 1、转氨酶液的制备 取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。 2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按表1操作,表1,5.5cm,1cm,用铅笔作出点样位置,用铅笔尖在圆心处截一小孔,3、层析 准备： 取新华定性滤纸（直径11cm）一张，找出圆心，用圆规画一直径2 cm的细圆圈（保持干净），并按图1用铅笔作出点样位置。找出圆心，用铅笔尖在圆心处截一小孔（孔径约0.2cm)。 另取2cm×3cm滤纸，先将下端剪成须状，卷成“灯芯”，备用。,2cm,3cm, 点样：用毛细管依次点标准丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次，其余14号管样液各点23次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。,2,11号管反应样液（ 丙氨酸 ） 22号管反应样液（ 丙氨酸 ） 33号管反应样液 44号管反应样液（ 丙氨酸 、谷氨酸） 5标准样液：丙氨酸 6标准样液：谷氨酸,3,2,4,5,1,6, 展层、显色 将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中, 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（80 ）中显色3min。,4,3,2,图1层析装置示意图,1. 康氏皿 2. 展层溶剂 3. “灯芯” 4. 层析滤纸,1,谷氨酸,丙氨酸,丙氨酸,氨基酸样品的分离图谱,溶剂前沿,原点,6,5,1,2,3,4,氨基酸样品的分离图谱,六、结果分析讨论 七、思考题 1.为什么要设计4支反应管？每管所要说明的问题是什么？ 2. 观察实验现象，并对层析后氨基酸的显色情况进行分析。 八、注意事项 1、避免污染滤纸，不要用手接触。 2、点样时，毛细管与滤纸轻微接触，不要留下痕迹。 3、实验报告附上层析滤纸。,下 次 实 验,“自主实验设计与实践”,（要求在45周的正常实验课时间段内完成自主设计实验课题）,
