王镜岩生化课件06 核酸.ppt

第六章 核 酸,第一节 核酸的化学组成,P330 表5-1 两类核酸的基本化学组成 RNA： D-核糖， A、G、C、U碱基 DNA： D-2-脱氧核糖， A、G、C、T碱基,一、 碱基 1. 嘌呤碱： 腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 2. 嘧啶碱： 胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 T P331 结构式 3. 修饰碱基： 100余种，多数是甲基化的产物 植物中有大量5-甲基胞嘧啶。 E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。,二、 核苷与脱氧核苷 核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型 嘧啶碱： C1 N1，嘌呤碱： C1 N9。 P332 结构式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷,三、 核苷酸 核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化 P332结构式：5-AMP 3-dCMP,1、 构成DNA、RNA的核苷酸 P481表13-4 DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMP RNA： AMP、 GMP、 CMP、 UMP 2、 细胞内游离核苷酸及其衍生物,核苷5-多磷酸化合物 ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG 在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。 环核苷酸 3,5-cAMP， 3,5-cGMP 激素的第二信使，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。 核苷5多磷酸3多磷酸化合物 ppGpp pppGpp ppApp 核苷酸衍生物 HSCoA、 NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。 GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。,第二节 DNA的结构,一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。 二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的 双螺旋结构。 三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,一、 DNA的一级结构 dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。 P483 图 13-2 写法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3,二、 DNA的二级结构 1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。,Chargaff 规律 1950年 a. 所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。 P486。 b. DNA的碱基组成具有种的特异性。 c. DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。 d. 年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。, DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。Franklin 相对湿度92%：BDNA。 相对湿度75%：ADNA。 ZDNA。,1、 Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA) P486图135 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧。 磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。 两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢链结合在一起。 A=T、G=C 每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，螺距：3.4nm，双螺旋平均直径2nm， 大沟：宽1.2nm ，深0.85nm，小沟 ：宽0.6nm，深0.75nm P487 图13-6 13-7,2、稳定双螺旋结构的因素 碱基堆积力（主要因素） 形成疏水环境。 碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。 磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。 碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。,三、 DNA二级结构的多型性 P489 表13-6 A-、B-、Z-DNA的比较 1、 BDNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA 右手双股螺旋 每圈螺旋10.4个碱基对 螺旋扭角36° 螺距：3.32nm 碱基倾角：1° 生物体内DNA均为BDNA。,2、 A-DNA 在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。 右手双螺旋，外形粗短。 RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 3、 Z-DNA 左手螺旋的DNA。 天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,4、 DNA三股螺旋（ H-DNA） DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。 第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。,四、 DNA二级结构的不均一性 1、 反向重复序列（回文序列） DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。 较长的回文结构，可形成茎环结构和发夹结构。 转录的终止作用与回文结构有关。 较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。 2、 富含AT的序列 很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。,五、 环状DNA 某些病毒DNA 某些噬菌体DNA 某些细菌染色体DNA 细菌质粒DNA 真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA,1、 环状DNA的不同构象,P491图13-12 松驰环、 解链环、 负超螺旋,（1）、 松弛环形DNA 线形DNA直接环化 （2）、 解链环形DNA 线形DNA拧松后再环化 （3）、 正超螺旋与负超螺旋DNA 正超螺旋：在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。 负超螺旋：在绳子一端向松弛方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。,2、 环形DNA的拓扑学特性 以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。 连环数（L） DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。 松驰环：L=25 解链环：L=23 超螺旋：L=23,缠绕数（T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示 松驰环T=25 解链环T=23 超螺旋T=25 超螺旋周数（扭曲数W） 松驰环W=0 解链环W=0 超螺旋W= -2 L=T+W,比连环差（） 表示DNA的超螺旋程度 =（LL0）/L0 L0是指松驰环形DNA的L值 天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。 负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等,Superhelix density =/=每一圈初级螺旋（10bp，360°）出现超螺旋数 不同生物的DNA分子的大小不同形成几乎相同的超螺旋密度 SV40 5226bp T=522 W=-26(L=496) =-0.05 E.coli 4.2X106bp T=4.2X105 W=4.2X105X-0.05=-2X104 一般天然DNA分子中=-0.05=5%负向超螺旋,3、 拓扑异构酶 改变DNA拓扑异构体的L值。 拓扑异构酶酶I（拧紧） 能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。 拓扑异构酶酶II（拧松） 能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。,六、 DNA的生物学功能 首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。 P342 14 Avery的肺炎双球菌转化实验,第三节 RNA的结构,一、 RNA的一级结构 AMP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。 P484 图13-3 RNA基本结构, 组成RNA的戊糖是核糖 RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。 天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。,二、 RNA的类型 核糖体RNA： rRNA 转运 RNA： tRNA 信使 RNA： mRNA 核内小RNA： snRNA （small nuclear RNA ） P344 表5-7 大肠杆菌中的RNA,三、 tRNA的结构 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右 有较多稀有碱基 图 3末端为CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。 5末端大多为pG或pC 二级结构是三叶草形 P496 图46-18 tRNA的二级结构（三叶草模型）,四、 mRNA的结构 1、 真核mRNA的结构 （1）、 3-端有一段约30-300核苷酸的polyA。 PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。 PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。 （2）、 5-帽子 P346 帽子结构：,帽子结构： 3-mG-5ppp5-Nm-3-P 5末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5-5-磷酸二酯键。 帽子的功能： 可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。 可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。,2、 原核mRNA的结构（多顺反子） 由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5帽子和3polyA。 SD序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。 SD序列和核糖体16S的rRNA的3末端富含嘧啶碱基的序列互补。,六、 rRNA的结构 rRNA与核糖体蛋白结合一起构成核糖体。 大肠杆菌中有三类rRNA：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA 真核细胞有四类rRNA：5S rRNA，5.8S rRNA，8SrRNA 28S rRNA P346 图5-14 大肠杆菌 5S rRNA 结构,第四节 核酸的性质,一、 解离性质 磷酸和碱基能发生两性解离。 DNA等电点 44.5 RNA 等电点 22.5,二、 水解性质 1、 碱水解 室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。 图 在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。 DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义： DNA稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,2、 酶水解 RNA水解酶 RNase DNA水解酶 DNase 核酸外切酶 核酸内切酶 ：限制性核酸内切酶,三、 光吸收性 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收， max=260nm 1、 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。,2、 含量计算 1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL核苷酸 3、 增色效应与减色效应 P347 图5-15 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。,四、 沉降特性（DNA） 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。 P348 图516 Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA 相对沉降常数 线型双螺旋分子 1.00 松驰双链闭环 1.14 切刻双链环 1.14 单链环 1.14 线型单链 1.30 正超或负超螺旋双链环状 1.41 坍缩 3.0,五、 变性、复性 1、 变性 核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 P350 图5-18变性过程 因素 ：热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） 变性后 ：260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。,（1）、 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在7085之间。,（2）、 影响DNA的Tm值的因素 DNA均一性 。 均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。 G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）×2.44 P351图5-19 图5-20 Tm值与GC含量的关系 介质中离子强度 其它条件不变，离子强度高，Tm高。 P351 图5-21,2、 复性 变性DNA在适当（一般低于Tm2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。 变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。 复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。,P352 图5-22，不同DNA的复性时间。 1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0m mol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。 复性机制：10-20bp成拉链,第五节 核酸研究技术,一、 核酸的分离纯化 尽可能保持其天然状态。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。,1、 DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。,2、RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化） 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。 去蛋白：盐酸胍、苯酚等 必须防止RNA酶对RNA的破坏。,二、 核酸的凝胶电泳 1、 琼脂糖电泳 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度 DNA的构象，超螺旋最快， 线形其次，环形最慢。 电流，不大于5V/cm 2、 PAGE电泳,三、限制性核酸内切酶（1979年发现） 1、 限制修饰系统 图,2、 II型核酸内切酶 限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。 II型酶的切割频率 识别位点 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 限制酶的命名：E.coRI 第一位： 属名E（大写） 第二、三位：种名的头两个字母小写co 第四位： 菌株R 第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号,同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。 BamHI：GGATCC BstI GGATCC MboI GATC Sau3A GATC 同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。 BclI TGATCA BglII AGATCA 星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。 例如 HindIII AAGCTT,四、 DNA物理图谱及构建 （限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱） 在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。 末端标记法构建DNA物理图谱： （1）单酶完全降解和部分降解 （2）双酶降解 图,五、 分子杂交 1、 Southern Blotting P353 图5-23 DNA样品 酶切 电泳 变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜） 固定（80，4-6h） 杂交（高盐浓度，68，几小时） Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。 可用DNA或RNA探针。,2、 Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、 Western Blotting 是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 抗原与抗体的杂交,六、 DNA序列分析 （一） 化学裂解法（Maxam-Gilbert 法） 原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。,32P-GCTACGTA 特异性化学裂解 在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和 32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG,硫酸二甲酯特异切割：G 甲酸特异切割：G和A 肼在Nacl条件下切割：C 肼在无 Nacl条件下切割：T和C 32P *ACTTCGACAA 硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC *ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA 肼（有Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA 肼（无Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT *ACTTCGA 从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。,（二） 双脱氧终止法 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖 1980 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。,（三） 序列分析仪 四色荧光基团标记的ddNTP,七、 DNA合成（探针、引物、基因） 1、化学合成：固相合成法（亚磷酸三酯法） P353 合成过程 合成方向：3 5端 5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3-OH用氨基磷酸化合物活化 碱基上氨基用苯甲酸保护 保护： 5-OH、活化3-OH、保护所有NH2,2、 DNA的酶合成PCR 模板DNA（单链） 引物 DNA聚合酶 dATP、 dGTP、dCTP、dTTP 一定浓度的Mg2+ 合成方向：5 3端 化学合成：方向3 5，不需DNA模板，酶。 生物合成：方向5 3，需模板，引物，DNA聚合酶。,