实验4 Feulgen反应制作细胞DNA定性、定量测量样品.ppt

实验 4 Feulgen反应制作细胞 DNA定性、定量测量样品,一、实验目的,1掌握临时制片法。 2熟悉Feulgen反应的原理及操作步骤。 3观察细胞中DNA的分布,2019/2/27,1,二、实验原理,标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。 2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3,2019/2/27,2,二、实验原理,HCl+Na2S2O5 亚硫酸根 亚硫酸根+碱性品红 无色的亚硫酸品红Schiff试剂 DNA在60，1 mol/L HCl溶液作用下形成半缩醛羟基， 与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物。,2019/2/27,3,三、实验器具与药品,每组学生 复式显微镜（带油浸物镜）；擦镜纸；记号笔；小片滤纸；载玻片；镊子；Carnoy固定液；Schiff试剂；1mol/L HCl；自来水；香柏油、二甲苯；甲基绿 整个实验班 恒温水浴锅两台,2019/2/27,4,四、实验方法,每人做三片：样品；对照 固定酸解水洗避光染色 亚硫酸水漂洗水洗压片镜检,2019/2/27,5,介绍：RNA显色Brachet反应,甲基绿-派洛宁为碱性染料，它能分别于细胞内的DNA和RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中的DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易于聚合程度高的DNA结合呈现绿色，而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能与派洛宁结合呈现红色。总的说来，RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。,蟾蜍血细胞Brachet染色 蓝绿色部分为DNA，红色部分为胞质和核仁的RNA,2019/2/27,6,五、实验结果,实验组经Feulgen反应显示核结构细致、清晰，细胞核染成粉红色至紫红色，核仁不着色。 对照组由于DNA没有释放出醛基，细胞核无红色出现。,2019/2/27,7,六、注意事项,酸水解时必须掌握合适的浓度、水解温度和时间，如果酸水解不足，会造成醛基暴露不完全；反之会造成DNA间键的断裂溶解，对DNA的定量测量产生不良影响。 在Schiff试剂中染色（切记在避光处反应）时，如室温过低会影响染色效果，使染色极浅。可适当加温（置于30度左右温箱中）或延长反应时间。 漂洗不充分造成非特异染色。,2019/2/27,8,七、思考题,1. 简述Feuglen反应的关键步骤是哪些？ 2. 你对此实验有何改进建议？,2019/2/27,9,