实验九_卵磷脂的提取和鉴定.ppt
实验九 卵磷脂的提取、纯化和鉴定,2008年12月,1、学习和掌握卵磷脂的提取和鉴定方法； 2、掌握薄层层析的原理、方法和应用。,一、实验目的,是细胞膜磷脂双分子层的重要成分。 卵磷脂又称磷脂酰胆碱，是甘油磷脂的一种。在动植物体内均有分布，在动物的脑、精液、心、肝、肾上腺和卵细胞中含量较多，蛋黄中含量可达8-10。 其结构式为：,胆 碱,HO,磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿，部分溶于乙醇，极难溶于丙酮；卵磷脂溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂，但不溶于丙酮；丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。 因此，本实验用乙醇、乙醚为溶剂，丙酮为沉淀剂，干燥后获得卵磷脂。新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈黄褐色。卵磷脂中的胆碱，在碱性溶液中可分解为三甲胺，而具有特异的鱼腥味，可用于鉴定。,二、实验原理 （一）卵磷脂的提取和纯化,物质提取、纯化受到多种因素的影响，如抽提物的种类及其配比、抽提条件（温度、时间等）都能影响提取的结果。这种多因素的试验可以通过正交法，即用一特制的表格正交表来安排试验，计算和分析试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。 本实验运用正交法抽提物的种类及其配比、时间温度和料液比这4个因素对卵磷脂提取和纯化的影响，并求得在什么样的条件下可以达到最佳的试验效果。,正交法实验设计,表1 抽提物、温度、时间和料液比4因素3水平,表3 L9 表,按一般方法，如对4个因素3个水平的各种搭配都要考虑，共需做3*3*3*3=81次试验，而用正交表只需做9次试验，即选用L9表(L是正交表的代号，下标数字表示试验次数)。,表4 试验安排,将本试验的4个因素依次放在L9表的第1，2，3，4列，再将各列的水平数用该列因素相应的水平写出来，就得到上表的试验安排。,（二）薄层层析,薄层层析（TLC）是一种微量而快速的层析方法。其层析是在吸附剂（固相支持物）均匀涂布的的薄层上进行的，故称薄层层析。而待分析的样品，是点加到薄层板的一端，然后将该端浸入适宜的展层剂中，在密闭的层析缸中展层。,由于各种物质的结构和性质的不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。吸附力大的易被吸附剂吸附，而较难被展层剂所解吸。吸附力小的则不易被吸附剂吸附，而易被展层剂携带至较远的距离。这样，各种物质在吸附剂和展层剂之间反复多次的被吸附与解吸附，就表现出不同的迁移率而得以分离，并可以通过与显色剂的显色反应而得到鉴定与区分。,（一）卵磷脂的提取和纯化 1、实验材料：鸡蛋黄 2、仪器：恒温水浴锅 蒸发皿 漏斗 磁力搅拌器 天平 3、试剂： 95乙醇 乙醚 丙酮,三、实验材料、仪器和试剂,1、实验材料：提取的卵磷脂 2、仪 器： 电热鼓风干燥箱、 层析玻璃板、 层析 缸、吹风机、小型喷雾器 。 3、试 剂： （1）硅胶-G； （2）0. 2%羧甲基纤维素钠溶液； （3）展层剂 ：氯仿甲醇水(65254) ； （4）显色剂：1% 碘液。,（二）卵磷脂的薄层层析,1、卵磷脂的粗提 蛋黄10g放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇40ml，搅拌15min后，静置15min；然后加入10ml的乙醚，搅拌15 min后，静置15min；过滤；滤渣进行二次提取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1)的混合液30ml，搅拌、静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷脂粗品。,四、实验步骤 （一）卵磷脂的提取,2卵磷脂的纯化 取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl2水溶液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4）洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。,（二）卵磷脂的薄层层析,1、调浆：称取硅胶-G 4.5g 烧杯 12ml 0. 2%羧甲基纤维素钠溶液用玻璃棒调匀搅拌为浆状液。 2、涂布：取洁净、干燥玻璃板一块下衬一张白纸在桌面上放平用烧杯将浆状物均匀倒在玻璃板上，从一端开始，保持均匀一致，涂布面积1 4/5 。 3、干燥：在室温下凉干2分钟60干燥箱烘30分钟。 4、活化：将干燥箱升温至120 ，活化30分钟后，关闭电源，当玻璃板面温度降至不烫手时取出。,5、点样：样点距玻璃板一端下缘1cm ，相互间隔11.2 cm ；每位点重复点五次，每次用冷风吹干后再点，每次点样直径不超过2mm 。 6、展层：在层析缸中加入展层剂0.5cm深，加盖平衡30分钟，将点样端浸入，密闭展层10-30min。后取出薄层板，标出展层剂前沿位置，用电吹风热风将薄层板吹干。 7、显色：用喷雾器向薄层板上均匀喷洒1%碘液溶液，热风吹干至色斑显现。,五、实验结果,1、卵磷脂收率 卵磷脂收率 = 卵磷脂粗品重量 / 蛋黄重量×100% 2、计算各组分的Rf 值 3、判断卵磷脂粗提物的组分,四种磷脂标准品的f值分别为:溶血卵磷脂0.18；神经鞘磷脂0.33；卵磷脂0.65；磷脂酰乙醇胺0.96,O,A,B,C,D,O1,O2,E,六、思考题：,1、简述卵磷脂的生物学功能。 2、磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇 胺（脑磷脂），磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇 的结构式。 3、何谓薄层层析？其原理和方法？ 4、制备硅胶-G薄层板与点样时应注意些什么问题？ 5、本实验中，哪一种组分的Rf值大一些？ 为什么？,
