食品生物技术基础-动物细胞工程.ppt2.ppt

第三章 细胞工程与食品产业 第一节 细胞工程概述 第二节 植物细胞工程 第三节 动物细胞工程 第四节 细胞工程在食品工业中的应用,第三节 动物细胞工程 一、动物细胞培养 二、核移植、胚胎移植 三、动物细胞融合技术 四、单克隆抗体,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核、胚胎移植,动物细胞工程常用技术,动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。其中，动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,动物细胞培养 许多动物细胞能够分泌蛋白质，如抗体等。但是单个细胞分泌的蛋白质的量是很少的，要获得大量的分泌蛋白就要借助于大规模的动物细胞培养了。 动物细胞培养液：通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生 素和动物血清等； 培养的动物细胞：大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物 的器官或组织。 动物细胞培养方式：原代培养、传代培养,动物细胞培养,1.发展历史: 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。 1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。 此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,2、动物细胞培养的应用和概念：,动物细胞培养: 指从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。,3、动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,3、动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,原代培养：初代培养亦称“原代培养”。指将欲待进行体 外无菌培养的组织或器官从母体取下后，经表面灭菌后，切成 合适的小块，置于培养基上进行培养的过程。由于外植体是直 接取自母体的，事前并未经过体外培养，因此将它们规定为第 一代培养物。通过继代培养，其体外繁殖体可供作第二、第三 乃至无数代的培养物。 传代培养： 继代培养 亦称“传代培养”。将培养的动植物 细胞、组织或器官乃至植物小植株从原来的培养基上转移到一 种新鲜的培养基上继续培养的过程称为继代培养。它是培养物 连续传代的一种方法，每转移培养一次即称为一代。因此按转 移培养的次数确定继代培养的代数。通过继代培养可以使培养 的细胞、组织或植物小植株能不断获得新鲜补充的营养物质， 可以避免在原培养基中所积累的一些有毒物质对培养物的不利 影响，从而可以使培养物不断生长和增殖。,概念,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,思考讨论：在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？,胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织 细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶 解，获得单个细胞。,3. 动物细胞培养的条件,1.无菌无毒的环境 2.营养 3.温度和pH 4.气体环境,（1）生产蛋白质生物制品 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体,（2）检测有毒物质,（许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。）,（3）为烧伤病人植皮 如何利用动物细胞培养技术，解决为烧伤病人植皮问题?,（利用动物细胞培养技术中细胞的贴壁生长和接触抑制特点，可以用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞供植皮所需。）,（4）用于科学研究 （生理、病理、药理）,4. 动物细胞培养技术的应用,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,DMEM培养基,胎牛血清,其他成分,锥形瓶逐级放大培养,加碱（碳酸氢钠）,加糖（葡萄糖）,灌注培养液,微载体,5L种子罐培养,培养液,50L 生 物 反 应 器,接种狂犬 病毒,出液口,收获病毒,植物组织培养和动物细胞培养的比较,原理,细胞的全能性,细胞增殖,植物组织培养和动物细胞培养的比较,培养基性质,固、液体培养基,液体培养基,植物组织培养和动物细胞培养的比较,培养基特有成分,蔗糖 植物激素,葡萄糖 动物血清,植物组织培养和动物细胞培养的比较,培养结果,植物体,细胞株、细胞系,植物组织培养和动物细胞培养的比较,培养目的,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白等,植物组织培养和动物细胞培养的比较,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强。,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养。,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。,二、动物体细胞核、胚胎移植技术和克隆动物,动物核移植： 指将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中。使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。,胚胎移植技术,胚胎移植技术 指将一个生物体内的胚胎移植到另一个生物体内繁殖的技术，这样可能大量繁殖优良的品种。先注射雌性激素在一雌性动物的体内，促使其大量排卵，然后在体外人工受精后发育成为胚胎后再植入其它同类动物的子宫内使其发育成为个体。大大提高了繁殖率。,胚胎移植技术,胚胎移植的基本程序如下（以牛胚胎移植为例）,克隆技术,克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,多莉,克隆猴,克隆牛,体细胞核移植技术的应用前景,(1) 遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物 (人)生长、发育、衰老和健康等机理的研究； 有利于大量培养品质优良的家畜; 经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官； (4) 科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆,即借腹怀胎的新领域,这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。,克隆技术将对21世纪产生的重大影响,三、动物细胞融合 动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是相同的，诱导融合的方法也相类似，动物细胞的融合还常常用到灭活的病毒作为诱导剂。 很多不同种类的动物细胞之间或动物与人的细胞之间都能进行融合，形成杂种细胞，例如人鼠、人兔、人鸡、人蛙、鼠鸡、鼠兔、鼠猴等的细胞都能进行融合。 动物细胞融合技术最重要的用途，是制备单克隆抗体。,细胞融合是用自然或人工方法，使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。 植物细胞由于具有细胞壁，在进行人工诱导融合之前，必须先脱除其细胞壁释放出原生质体才能进行融合。 动物细胞可直接用于融合。 人工诱导动物细胞融合的方法有病毒诱融法、化学诱融法和电刺激诱融法等。 植物原生质体人工诱融法见“原生质体融合”。细胞融合过程应包括核基因和胞质基因(如线粒体和叶绿体基因)的融合。,动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化学法,仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,细胞融合与融合诱导细胞融合物质,诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇 诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。 思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？,动物细胞融合,（1）基本原理： 细胞膜的流动性。 （2）诱导剂： 灭活的仙台病毒、PEG等。 （3）用途： 制备单克隆抗体。,动物细胞融合（总结）,2.诱导融合的方法：,1.自然条件下的细胞融合现象,3.融合的具体过程：,先是细胞质融合，细胞核的融合是在第一次有丝 分裂时完成的。,动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的有 （ ） A诱导融合的方法完全相同 B所用的技术手段完全相同 C所采用的原理完全相同 D都能形成杂种细胞,解析 所用的诱导方法略有不同：除了植物细胞融合所用的诱导方法外，动物细胞融合还常用灭活的仙台病毒做诱导剂。动物细胞融合和植物体细胞杂交，这两项细胞工程技术中都包含了细胞融合过程，两种细胞融合所用的技术手段基本相同，但不完全相同。动物细胞融合采用的原理是细胞膜的流动性，植物体细胞杂交采用的原理是细胞膜的流动性和细胞的全能性。动物细胞融合和植物体细胞杂交过程中均能产生杂种细胞，只不过是动物的杂种细胞在现有技术条件下，还不能发育成一个个体，它的全能性还不能表现出来，植物的杂种细胞就不一样了，植物的杂种细胞可以通过组织培养技术形成杂种植株。,D,四、单克隆抗体 在动物发生免疫反应的过程中，体内的每一个B淋巴细胞分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，也就是通过克隆，形成细胞群，这样的细胞群就有可能产生出化学性质单一、特异性强的抗体单克隆抗体。 免疫系统是由机体内的淋巴细胞组成的，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。抗原(如病毒、细菌等非自身物质)进入身体后，T淋巴细胞产生多种淋巴因子排斥抗原，B淋巴细胞在T淋巴细胞协助下，分化出许多浆细胞。每个浆细胞能生产无数杀伤癌变细胞或病毒的物质，即抗体。由一个B淋巴细胞分化的一群浆细胞称为“纯系”或“克隆”。由一个克隆产生的抗体即为单克隆抗体。,什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞产生抗体。,B淋巴细胞与抗体,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生 抗体。 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万 种以上的抗体，每种抗体对特定的抗 原具有特异性免疫作用。 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体。 特点： 特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,单克隆抗体的制备 英国科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒在前人工作的基础上，继续探索和尝试，并且充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案。 他们首先将抗原注射入小鼠体内，然后从小鼠脾脏中获得能够产生抗体的B淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合，再在特定的选择性培养基中筛选出杂交瘤细胞。由于杂交瘤细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此，它不仅具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，还有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的本领。 他们培养杂交瘤细胞，从中挑选出能够产生所需抗体的细胞群，继续培养，以获得足够数量的细胞，在体外条件下做大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖。这样，从细胞培养液或小鼠的腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,小鼠骨髓瘤细胞可以在体外培养条件下大量增殖，B淋巴细胞能够产生抗体，细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体。,3、骨髓瘤细胞是癌细胞吗?,有无限增殖能力（失去凋亡机制，失去接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以说，瘤细胞不能等于癌细胞。,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,（4）整个制备过程为何要经过两次细胞筛选?,（4）整个制备过程为何要经过两次筛选?,第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。 许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,第三章 细胞工程与食品产业 第一节 细胞工程概述 第二节 植物细胞工程 第三节 动物细胞工程 第四节 细胞工程在食品工业中的应用,干细胞工程,干细胞定义 现在发现哺乳动物的许多已分化组织和器官中都保留了一些能够分裂形成该组织或器官的未分化原始细胞，这些细胞称为干细胞。 干细胞形态特征： 圆形，椭圆型，体积小，核质比大，具有较强的端粒酶活性，因此具有较强增殖能力。,干细胞增殖特性 缓慢性，自稳性 干细胞分类 人体干细胞基本分为三种类型：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。,·干细胞分化模式 ·胚胎干细胞(embryo stem cell)：具有分化成多种细胞类型及构建组织的潜能。 ·造血干细胞 ·单能干细胞（monopotential cell）,体内干细胞的意义在于源源不断地补充体内一些短命组织的细胞来源，如血液细胞、皮肤细胞以及精巢等，或者组织或器官受到局部损伤时，它们可以再分裂形成新的该组织和器官，是体内的一种自我修复机制。 人类干细胞工程就是利用人体内干细胞的特征来达到体外产生人类所需的产物的探索。主要用于器官修复，基因治疗等。,1. 动物细胞工程技术的基础是：（ ） A动物细胞融合 B胚胎移植 C动物细胞培养 D核移植,在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正 确的是（ ） A结果是相同的 B杂种细胞的形成过程基本相同 C操作过程中酶的作用相同 D诱导融合的手段相同,. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞 A B C D,C,4. 单克隆抗体是指 A单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体 B单个B淋巴细胞增殖产生的抗体 C单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体 D单个抗体通过克隆化，产生大量抗体,C,5. 将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细 胞经培养产生单克隆抗体，其依据是（多选） （ ） AB淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖 BB淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合后才能产生抗体 C骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能产生抗体 D骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能无限增殖,AC,要想获得大量的单克隆抗体就必须用单个的B淋巴细胞进行无性繁殖，形成细胞群。其原因是（ ） A在体外培养条件下B淋巴细胞可以无限增殖 B在动物体内B淋巴细胞可产生多达百万种以上的抗体 C每一个B淋巴细胞都参与特异性免疫反应 D每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体,D,7、关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是（ ） A、可以制成诊断盒用于疾病的珍断 B、可以与药物结合，用于病变细胞的定向治疗 C、可以利用基因工程技术生产 D、可以在生物体内生产，不能体外生产,D,8. 由A、B两种细胞人工融合成D细胞的过程中，常用（ ）或（ ）作为诱导剂。融合过程包括（ ）和（ ）两方面，D细胞称为 ( )细胞。,PEG(聚乙二醇)或（灭活的病毒) 膜融合 核融合 杂种,9. 若由D细胞培育成植株，可用（ ) 技术，这一培养过程要经 过 和 两个阶段。目前，植物体细胞杂交还有许多理论和技术问题没有解决，如杂种植物还不能按照人们的需要表现出亲代的优良性状，从遗传学角度分析，其内在因素很可能是 。,植物细胞培养 脱分化 再分化 控制优良性状的基因还不能表达,10. 如需制备单克隆抗体，则D细胞应具有( )和( )的能力。,分泌特异性抗体 大量增殖,11. 近年来，有人将巴龙霉素产生菌(A种)和高产但为营养缺 陷型的变种菌(B种)进行细胞杂交，获得了巴龙霉素产量 比原始菌株大56倍的新型菌种。试回答以下问题： （1）在进行细胞融合时，首先应使用适当的酶去除菌体的 细胞壁，然后用理化方法促使 融合。 （2）在这一细胞杂交过程中，能形成 种类型的融合细 胞，合乎人们要求的是 (用字母表示)细胞。,(1)原生质体 （2）三 AB型,12. 上图是单克隆抗体制备过程示意图。据图回答： （1）通过过程得到的B淋巴细胞从小鼠体内分离出之前，应对小鼠进行的处理是 ( )，该处理的实质是在小鼠体内发生( )反应。 注射相应抗原 体液免疫 （2）骨髓瘤细胞与进行原代培养的细胞相比较，核内的结构发生的主要变化是( )，从而违背了“程序性细胞死亡”规则，打破了细胞产生与死亡的动态平衡。 遗传物质（原癌基因）发生了改变,上图是单克隆抗体制备过程示意图。据图回答： （3）试设想运用生物工程其它领域的技术制备单克隆抗体的一条途径( )。 运用基因工程方法制造含有某种抗体的基因的工程菌进行发酵生产,13. 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,