肿瘤标志物的研究历史.ppt

本科癌基因与抑癌基因,1,肿瘤标志物的研究历史,第1阶段（1963-1978）：癌胚性抗原 1963年 Abelev AFP 1965年 Gold & Freeman CEA 第2阶段（1979-1989）：糖链抗原为主 1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9） 1981年 Bast et al CA125（OC125） 第3阶段（1990以后）：基因标志 肿瘤基因标志,第四章 癌基因与抑癌基因,本科癌基因与抑癌基因,2,1910 Rous 肿瘤病毒 鸡肉瘤上清,基因肿瘤标志物研究简史,1989 Ebralidze 肿瘤转移基因 mts1 鼠乳腺肉瘤,1988 Steeg 肿瘤转移抑制基因 nm23 鼠黑色素瘤,1987 Lee 抑癌基因,1986 Dryja 抑制肿瘤生长基因Rb,1976 Bishop 原癌基因（V-src)、癌基因 1989 Nobel,1970 Martin Rous肉瘤src基因,1960 Huebner 病毒肿瘤基因,本科癌基因与抑癌基因,3,癌的病因学曾有 病毒致癌 化学致癌 遗传因素 病毒癌基因 (virus oncogene，v-onc) 正常细胞癌基因 (cellular oncogene，c-onc) 抑癌基因 (suppressor gene),本科癌基因与抑癌基因,4,生长因子 生长因子受体 GTP酶 蛋白激酶 核蛋白 DNA合成,本科癌基因与抑癌基因,5,正常细胞的生长增殖由两大基因调控 正调控信号：促进细胞生长和增殖，并且阻止 其发生终末分化癌基因。 负调控信号：促进细胞成熟，向终末分化，最 后凋亡（apotosis）抑癌基因。,两种信号保持着动态平衡，对正常细胞的生长、增殖、死亡精确地调控，当平衡被破坏，正调控信号基因功能过盛或负调控信号基因失活，导致细胞增殖调控的混乱而使细胞恶变。,本科癌基因与抑癌基因,6,一、癌基因(oncogene，onc)及其表达产物的作用 1、定义： 癌基因包括病毒癌基因（v-onc）和细胞癌基因（c-onc）两种，具有潜在诱导细胞恶性转化的特征。,第一节 癌 基 因,本科癌基因与抑癌基因,7,2、特点： （1）v-onc是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能 引起细胞转化 （2）c-onc是存在于正常细胞基因组中的癌基因， 在正常情况下处于静止或低表达的状态，不 仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具 有重要作用，但在异常表达时，其产物可使 细胞无限制分裂。,本科癌基因与抑癌基因,8,（3）癌基因的表示 用3个斜体小写字母表示，如ras、src、myc等 病毒癌基因：在其名称前冠以前缀“v”，如v-ras， 细胞癌基因：在其名称前冠以前缀“c”，如c-ras。,本科癌基因与抑癌基因,9,(一)病毒癌基因 病毒癌基因是在以Rous肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)为代表的逆转录病毒中发现的。,本科癌基因与抑癌基因,10,Point mutations identified in human tumors,本科癌基因与抑癌基因,11,Oncogen amplification in human tumors,SCLC: small cell lung carcinoma,本科癌基因与抑癌基因,12,Chromosomal translocations commonly occurring in human tumors,本科癌基因与抑癌基因,13,在正常情况下，病毒癌基因无活性，一旦受到辐射或化学致癌剂的影响，就会全部或部分活化，诱导肿瘤的发生。,本科癌基因与抑癌基因,14,(二)细胞癌基因 在正常细胞中存在癌基因，被引入正常细胞时能使正常细胞转化为癌细胞。将细胞中的这种癌基因称为细胞癌基因(c-onc) 或原癌基因(proto-onc)。,本科癌基因与抑癌基因,15,细胞癌基因与病毒癌基因核酸序列有同源性即它们的DNA序列是相对应的，表达产物也基本相同。,本科癌基因与抑癌基因,16,细胞癌基因的作用：通过其表达产物蛋白质来体现的，通常根据编码的表达产物的功能 细胞癌基因分类,本科癌基因与抑癌基因,17,1、sis家族 一个基因，即c-sis 定位：人类第22号染色体，5个外显子 编码：241个氨基酸的蛋白质（p28） 特点：与人类的血小板衍生生长因子（PDGF）有 87%的同源性，可与PDGF受体结合。,本科癌基因与抑癌基因,18,作用：PDGF能促进结缔组织细胞及神经胶质细胞 的增殖，故c-sis作用于PDGFR，可刺激细 胞的生长及转化。,PDGF/sis,本科癌基因与抑癌基因,19,2erb家族 表达产物：细胞骨架蛋白 作用：在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及维持细胞形态方面具有重要作用。,本科癌基因与抑癌基因,20,人erb-B编码的是“掐头”的表皮生长因子(EGF)受体，这个“截短”受体和其配体-表皮生长因子长期结合，从而可永远向细胞内传导促进生长的信号。,与野生型受体相比，跨膜区域无变化，但受体的两端变短，尤其是全部细胞外结构区域都被删除。,本科癌基因与抑癌基因,21,本科癌基因与抑癌基因,22,3.src家族 定位： c-src定位于第20号染色体，17个外显子 编码： 60kDa的蛋白质,具酪氨酸蛋白激酶 (tyrosine protein kinase，TPK)活性。 特点：有一个250个氨基酸组成的同源结构区， 其表达产物均具有TPK活性。 作用：通过激酶的磷酸化作用，使其结构发生改 变，增加激酶对底物的活性，加速生长信 号在胞内的传递，与细胞无限生长关系密 切。,本科癌基因与抑癌基因,23,本科癌基因与抑癌基因,24,4ras家族 数量：H-ras、K-ras、N-ras H、K-ras分别来自大鼠肉瘤病毒Harvey、Kirsten株 N-ras从入神经母细胞瘤(neuroblastoma)中获得 编码：4个外显子组成， 蛋白质为21Kd 特点：编码的氨基酸顺序有85的同源性，主要 位于细胞膜的内侧面，属G蛋白 作用：参与细胞增殖信号的细胞内转导过程，是维 持细胞生长和分化的重要信号转换器。,本科癌基因与抑癌基因,25,ras与GTP结合时为活化状态，GTP水解后，ras与GDP结合形式为非活化状态。,本科癌基因与抑癌基因,26,本科癌基因与抑癌基因,27,本科癌基因与抑癌基因,28,5myc家族和myb家族 数量：c-myc,N-myc、L-myc、R-myc 编码：3个外显子组成，Exon1不编码，缺少ATG，但 多个终止密码子；另外两个外显子表达62- 64kDa或66-67kDa的蛋白 特点：位于核内，属于DNA结合蛋白类，与DNA复制 起动有关 myb家族编码的产物本身就是反式作用因子，在生长因子调控细胞增殖过程中起重要作用。 作用：两个家族的癌基因产物都位于细胞核内，可 与某些特定DNA相结合，影响DNA复制的起动 过程或对转录进行调控，从而实现其调节细 胞生长、增殖、分化的目的。,本科癌基因与抑癌基因,29,本科癌基因与抑癌基因,30,本科癌基因与抑癌基因,31,二、原癌基因的激活机制 原癌基因具有正常的生理功能，被激活时又具有致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。 现已证实 射线辐射 化学致癌剂 病毒感染,本科癌基因与抑癌基因,32,(一)原癌基因点突变(point mutation) 癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活性。,mutation,本科癌基因与抑癌基因,33,本科癌基因与抑癌基因,34,(二)原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的mRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示。 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因，使其表达产物增多。 病毒的增强子常位于5端的长末端重复序列(1ong terminal repeat，LTR)内。如果增强子插入到原癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的表达比正常表达增高几十甚至上百倍。,本科癌基因与抑癌基因,35,本科癌基因与抑癌基因,36,本科癌基因与抑癌基因,37,(三)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)对阻抑基因的转录具有重要作用。,本科癌基因与抑癌基因,38,现已发现在结肠腺癌和小细胞肺癌的细胞中，ras基因的DNA甲基化水平比其邻近的正常细胞明显偏低，提示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活。,本科癌基因与抑癌基因,39,(四)原癌基因的拷贝数增加 基因扩增(amplification)： 某些癌基因通过一些机制在原来的染色体上复制多个拷贝，超出了正常细胞的癌基因剂量，导致基因产物的增加，从而使细胞正常功能紊乱。 例如： 人视网膜母细胞瘤：N-myc扩增了10-200倍，相应的mRNA和蛋白质产物也都大量增加。,本科癌基因与抑癌基因,40,本科癌基因与抑癌基因,41,本科癌基因与抑癌基因,42,(五)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation） 基因重排（rearrangemant）： 有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生。,本科癌基因与抑癌基因,43,人c-myc基因定位于8q24，可易位到IgH(定位于14q32)、lg (定位于2p12)、Ig(定位于22q11)基因的高活性转录区，从而组成一个c-myc基因的高转录活性的重排基因，启动c-myc转录，使c-myc基因表达增强，促进细胞恶变，最终导致肿瘤的发生。,本科癌基因与抑癌基因,44,染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生。,本科癌基因与抑癌基因,45,第二节 抑癌基因 抑癌基因(suppresser gene)又称抗癌基因(anti-onc)，是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。,本科癌基因与抑癌基因,46,本科癌基因与抑癌基因,47,一、抑癌基因及其表达产物 抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反。,本科癌基因与抑癌基因,48,二、抑癌基因失活机理 1、视网膜母细胞瘤(retino-blastoma，Rb) （1）特点： 基因组成：27个外显子，3-17外显于区域是基 因重组和突变的热点。 编码：p105的蛋白质，其有结合DNA的活性，可 受多种激酶系统催化而发生磷酸化。,本科癌基因与抑癌基因,49,（2）作用： 不同程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完全消失。非磷酸化的Rb可防止细胞增殖，当DNA肿瘤病毒抗原结合了非磷酸化的Rb时，Rb的活性就受到抑制，使细胞转化为无限增殖状态，形成肿瘤。,本科癌基因与抑癌基因,50,RB,RB,E2F,E2F,P,P,P,RB dephospholated,E2F released activates transcription,RB binds E2F blocks G1/S transition,RB,P,P,P,RB phospholated,RB phospholation release cycle block,Represses target genes,RB-tumor suppressor,本科癌基因与抑癌基因,51,对于大量来自视网膜母细胞瘤的Rb基因序列进行分析，发现Rb基因完全或部分发生缺失；另一些Rb肿瘤中，基因完整，但序列分析显示有一个突变，它常发生于剪接点上，由于这一变异导致Rb mRNA组装时有外显于被漏掉，因而产生异常Rb蛋白质。,本科癌基因与抑癌基因,52,抑癌基因又称为隐性癌基因,基因1 基因2 原癌基因 M W 肿瘤 抑癌基因 M W M M 肿瘤,本科癌基因与抑癌基因,53,（2）p53基因 特点：17p13，11个外显子，10个内含子 编码：393个氨基酸，p53,本科癌基因与抑癌基因,54,作用：产物能结合DNA和被磷酸化。 （1）抑制肿瘤细胞停滞在修复前期不能进入S期复制DNA而促使细胞凋亡。,本科癌基因与抑癌基因,55,本科癌基因与抑癌基因,56,本科癌基因与抑癌基因,57,野生型p53的蛋白质 p53下调bcl-2而上调bax，促进细胞凋亡过程。向丢失p53等位基因的肿瘤细胞中导入野生型p53就会使肿瘤细胞凋亡,本科癌基因与抑癌基因,58,肝细胞癌p53基因249位G T,本科癌基因与抑癌基因,59,DNA damage,p53,本科癌基因与抑癌基因,60,三肿瘤发生中的基因变化 (一)肿瘤发生学说 多种致癌因素综合作用的结果 物理因素(如紫外线、电离辐射等) 化学因素(如黄曲霉毒素) 生物因素(DNA或RNA致癌病毒) 经多次打击多阶段变化便形成了肿瘤。,本科癌基因与抑癌基因,61,1、启动阶段 启动因子作用： 细胞的DNA分子已发生改变，但表型仍显示正常。 剂量： 以极低剂量与细胞接触一次，即可启动细胞癌变过程，各种干细胞及处于增殖状态的细胞比静止状态的细胞对启动因子的作用更加敏感。,本科癌基因与抑癌基因,62,2、促癌阶段 癌前细胞（表型正常而DNA已发生变化） 在启动因子和促癌因子的协同作用下，细胞的表型发生变化，表现出癌细胞的表型。,本科癌基因与抑癌基因,63,3、转化阶段 已恶变的细胞进入自主分裂增殖状态。促癌阶段形成的增生性病灶会进一步浸润、转移。,本科癌基因与抑癌基因,64,1,2,3,4,5,本科癌基因与抑癌基因,65,实验证： 肿瘤是由多步骤多阶段或多次打击而发生的疾病。 人类结肠癌的发展需要5-6个步骤的顺序 ras的突变 抑癌基因家族性多发性腺癌（FAP）、结肠 癌缺失(DCC)的丢失 c-myc基因的过度表达 p53的缺失 是这些变化的积累，而不是它们之间发生的顺序。,本科癌基因与抑癌基因,66,本科癌基因与抑癌基因,67,本科癌基因与抑癌基因,68,（二）原癌基因的激活 1、ras基因的变异 2myc基因的变异,本科癌基因与抑癌基因,69,(三)抑癌基因的失活 1、Rb基因的失活 2、p53基因的失活 3、其他： BRCA1和BRCA2：与遗传性高发乳腺癌相关的基因，与卵巢癌的发生也紧密相关。,本科癌基因与抑癌基因,70,第三节 原癌基因与抑癌基因的检测及评价,基因检测 核酸扩增: PCR, RT-PCR 凝胶电泳: DGGF (变性梯度凝胶电泳） 核酸杂交: Southern blot , Northern blot, FISH 基因芯片技术 基因产物的检测 蛋白质: 原位检测，ELISA, RIA,本科癌基因与抑癌基因,71,一、检测方法： 1、PCRASO探针法(PCR-allele-specific oligonucleotide 该方法快速、灵敏度高，但点突变的检出仅限于突变探针的探测位点，不能检出探针邻近部位的点突变。,本科癌基因与抑癌基因,72,2、限制性片段长度多态性(RFLP)分析,本科癌基因与抑癌基因,73,3、PCR-SSCP、测序等 突变更易于检出，扩增的DNA片段在非变性凝胶电泳中，因电泳迁移率不同，所有突变的ras基因均可与相应的正常基因区分开来。并且，若同一位点发生不同核苷酸替代形成的点突变，或同一核苷酸在不同位点替代形成的点突变，均可显示不同的电泳迁移率。,本科癌基因与抑癌基因,74,4、Southern Blot,autography,本科癌基因与抑癌基因,75,Single-color FISH,double-color FISH,本科癌基因与抑癌基因,76,基因芯片,Stanford 乳腺癌微矩阵(Perou et al.1999),本科癌基因与抑癌基因,77,三、肿瘤相关基因检测的临床应用与评价 只有极少数人肿瘤与其相关基因有密切特异性，如视网膜母细胞瘤与Rb基因、家族性结肠息肉与APC基因具有很高特异性，大多数肿瘤还不可能归纳出特异的基因改变。 肿瘤的基因诊断尚不能作为第一诊断手段。,本科癌基因与抑癌基因,78,与肿瘤诊断有关的癌基因,在肿瘤中较普遍表达：c-myc、c-fos、H-ras、k-ras 在肿瘤中特异性表达：c-abl、c-sis 临床意义尚不明确：c-mos、cyes、cfps、c-sac等 白血病：abl、ras； 多发性结肠息肉：c-myc 结肠癌，胰腺癌，肺癌：ras 乳腺癌，卵巢癌：BRCA1、c-erbB-2,本科癌基因与抑癌基因,79,1) Oncogene amplification : neuroblastoma N-myc, C-erb-B2 2) Oncogene overexpression : small cell lung carcinoma C-myc 3) Oncogene mutation : bladder cancer H-ras 4) Suppressor gene deletion : retinoblastoma RB gene,肿瘤的早期诊断和筛检,肿瘤相关基因的临床应用,本科癌基因与抑癌基因,80,复习思考题,名词解释： 癌基因 细胞癌基因 基因扩增 抑癌基因 点突变,简答题： 1、简述原癌基因的激活机制。 2、简述肿瘤发生机制。,本科癌基因与抑癌基因,81,