胰蛋白酶的活力的测定.ppt

胰蛋白酶的活力的测定,一、酶的化学本质 概念 是一类生物催化剂。 化学本质 绝大多数酶是蛋白质，某些RNA或DNA也具有催化活性。,二、酶的化学组成,蛋白质的酶,单纯蛋白质的酶,全酶,酶蛋白apoenzyme,辅助因子cofactor,辅助因子 辅基/辅酶小分子有机化合物、金属离子，直接参加反应。直接对电子、原子或某些化学集团起传递作用。 酶蛋白 决定反应特异性（专一性）。 一种辅助因子可与多种酶蛋白结合；一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合。,三、酶的活性中心 必需基团 酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。 活性中心 酶分子中必需基团相对集中，构成一定空间结构区域，与催化作用直接相关。,活性中心,结合部位 （底物）,催化部位（底物的键在此处被打断或形成新的键）,用于判断和确定酶活型中心的主要方法： 1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。 2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。,四、酶的命名与分类 习惯命名法 按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸酶等。 国际系统分类,酶原与酶原激活 无活性的酶前身物称酶原。由无活性酶原转变为有活性酶的过程称酶原激活。 同工酶 分子结构不同、理化性质也不同，但催化同一化学反应的一组酶，如乳酸脱氢酶（LDH）。 别位酶 多亚基组成，其中有催化亚基、有调节亚基，小分子化合物结合调节亚基后分子构象改变，引起催化活性改变。,五、酶的活力测定,酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表示。,胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0，25，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。,初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准,酶活力与酶反应速度,时间,以N-苯甲酰-L精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进行测定的原理是：N苯甲酰L精氨酸乙酯英文缩写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。,操作方法 取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25予热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读34分钟。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）A253/min。,样品胰蛋白酶BAEE活性单位,每分钟A253nm增加值,0.001,