白刺液泡膜NaH逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析.doc

内蒙古大学本科毕业论文(设计) 本科毕业论文（设计）白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析摘要白刺属（Nitraria L.）是蒺藜科(Zygophyllaceae)的古老小属，中国有8种，内蒙古有4种该属植物是我国内蒙古、甘肃和新疆一带荒漠植被的重要建群种之一，为耐干旱、耐盐碱、抗风蚀沙埋、生长快、易繁殖的优良防风固沙先锋植物，而且具有很高的开发利用价值，因此开发其抗逆性基因资源、从分子生物学角度探讨耐盐机理具有重要的理论意义。盐胁迫是影响植物正常生长发育的最严重的非生物胁迫之一。植物盐害可分为原初盐害和次生盐害，原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害，即离子胁迫导致的伤害，包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的各种代谢过程；次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。植物的耐盐机制主要包括渗透调节和降低胞内Na+浓度。减少Na+的吸收、外排Na+和将Na+区域化是保持胞内低Na+浓度的策略，其中Na+的外排和区域化主要由Na+/H+转运蛋白调节。液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白是将胞质内的Na+逆Na+浓度梯度运送到液泡膜中进而将Na+区域化集中。目前为止一些植物的液泡膜Na+/H+逆向蛋白编码基因（NHX）已经被克隆，而且一些研究表明NHX基因的过量表达可显著提高植物的耐盐性。 本研究以开发白刺的耐盐基因资源、揭示其耐盐分子机理为目的、利用RT-PCR、RACE技术及iPCR的方法，从小果白刺(N. sibirica Pall)中克隆了NHX cDNA片断，并对其进行了经过同源序列比较及进化关系分析，从而为调查该基因的表达调控模式、作用机理及利用该基因进行甜土植物的耐盐性遗传改良奠定了基础。另外，本研究还克隆了小果白刺的肌动蛋白基因片断。由于肌动蛋白基因在各种不同器官上恒定表达，因而它常常被用作分子内标来研究其它基因的表达差异。小果白刺的肌动蛋白基因的克隆为今后研究NHX等白刺属植物的基因表达奠定基础。关键词：白刺，耐盐性，Na+/H+逆向转运蛋白，RT-PCRMolecular cloning and Sequence Analysis of a vacuolar Na+/H+ antiporter and Actin genes form Nitraria L.Wang LiLin XiaoFeiAbstractThe Nitraria L.is a small genus of Zygophyllaceae, which primarily grows in arid and semiarid regions, saline and alkali land, desert and sand areas, and is the major constructive species of forest in western Inner Mongolia. The Nitraria plants exhibit a strong salt-resistance, and have important economical- and ecological-value. Therefore, the research on molecular mechanism of stress tolerance is very necessary in Nitraria.Salt stress is one of abiotic factor that cause serious limitation on plant growth and development. Plant salt stress include primary salt and secondry salt, primary salt refers to the injury on plant by ions, including the damage of selective penetrated property of plasma membrane and interference on plant metabolism; secondary salt refers to the osmotic stress by excessive soil salinity and the nutrient loss by ion competition. Since the first vacuolar Na+/H+ antiporter gene, referred to as NHX, was cloned from Arabidopsis, more than 500 of NHX orthologs were isolated. Previous research indicated that over-expression of NHX gene can enhance salt-tolerance ability of plants.In the study, we isolated a cDNA fragment of NHX homology from N. sibirica Pall using RT-PCR, RACE and iPCR, and analyzed its gene structure and phylogenetic relationship. The results will prove an important experimental basis for analyzing the expression pattern and molecular mechanism of NHX gene, and for improving salt-resistant ability of glycophytes through genetic transformation with NHX genes of Nitraria L. On the other hand, we isolated a cDNA fragment of actin gene from N. sibirica Pall. The expression of actin genes are stable in each organs, therefore, it was used as an internal standard for analyzing gene expression. The experimental result could prove useful for gene-expression analysis of Nitraria plants.Keyword : Nitraria L.，salt-tolerance，Na+/H+ antiporter，RT-PCR 目录1 绪论71.1盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制71.1.1 盐胁迫对植物的伤害71.1.2植物的耐盐机制81.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）研究进展81.2.1液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征81.2.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现91.2.3 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的功能研究101.3 本研究的目的及意义122 材料与方法142.1 材料142.1.1植物材料的培养142.1.2 实验试剂及配制142.1.3 实验使用试剂盒152.1.4实验用引物162.1.5 载体及菌株162.1.6 主要仪器设备及其他162.2 实验方法172.2.1 兼并引物设计172.2.2 白刺总RNA的提取及鉴定182.2.3 cDNA第一链的合成192.2.4白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因cDNA片段的克隆202.2.5白刺肌动蛋白基因片段的克隆202.2.6大肠杆菌DH5超级感受态细胞的制备（TB法）212.2.7 PCR产物的凝胶回收及TA克隆的与转化212.2.8克隆基因片段序列的测定232.2.9白刺Na+/H+逆向转运蛋白cDNA 3末端的快速克隆（RACE）232.2.10 白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因5末端的获得252.2.11 Na+/H+逆向转运蛋白序列分析283结果与讨论293.1实验结果293.1.1 RNA的变性琼脂糖凝胶检测结果293.1.2 PCR产物鉴定293.1.3白刺Na+/H+逆向转运蛋白3末端cDNA的克隆303.1.4菌落PCR鉴定含重组质粒菌落303.1.5 白刺Na+/H+转运蛋白基因5末端的获得313.1.6序列的blast 比对结果313.1.7基因片段的Na+/H+逆向转运蛋白基因序列分析及系统树构建333.2讨论分析333.2.1 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳333.3.2 Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离343.2.3肌动蛋白基因的内参作用344 致谢365参考文献376 附录391 绪论1.1盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制干旱半干旱地区，水分蒸发把地下盐分带到土壤表层，造成土壤表层盐分过多；海滨地区海水倒流或咸水灌溉等因素，土壤表层会积累较多盐分。自然界中造成盐胁迫的盐分主要是NaCl、NaHCO3、Na2CO3、 Na2SO4，通常这些盐同时存在，称为盐碱土。全世界大约有20%的可耕土地及一半以上的水浇田受盐渍化影响，并且这种影响日益加剧。我国盐渍化土壤主要分布于北方和沿海地区，盐渍化使土壤水势下降。严重阻碍植物生长发育，已成为盐碱地区限制作物产量的主要因素【1】。1.1.1 盐胁迫对植物的伤害 植物盐害可分为原初盐害和次生盐害【2】，原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害，即离子胁迫导致的伤害，包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的各种代谢过程；次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。1.1.2植物的耐盐机制 不同植物对盐胁迫的适应方式不同，或者通过减少盐分在体内的积累逃避盐害，或者通过自身生理或代谢过程来适应或忍受细胞内的高盐环境。具体途径可分为：一是减少Na+的吸收及增加Na+的外排，植物细胞在确保其他离子吸收的条件下选择性的排斥Na+，不让其通过质膜，而高等植物的排Na+机制主要与质膜Na+/H+逆向转运体（SOS1）有关，质膜H+-ATPase 的主要功能是驱动质子排出质膜，建立跨膜pH梯度和电势差，即质子驱动力，提供能量驱动膜上Na+/H+逆向转运体，使质子顺电化学梯度进入细胞，同时Na+逆化学势排出细胞。二是盐分的区隔化，主要由液泡膜上质子泵、Na+/H+逆向转运体（NHX）和离子通道所调控。液泡膜上存在两类质子泵，分别为液泡膜H+-ATPase和H+-PPase，他们分别通过水解ATP和焦磷酸（PPi）产生能量将H+进行定向运输，在液泡膜两侧形成质子梯度【3】，提供能量驱动液泡膜上Na+/H+逆向转运体，从而使Na+进行跨膜运输，被动进入液泡。三是渗透调节作用，一些盐生植物依靠从外界吸收和积累无机盐离子，进行渗透调节防止盐害，或者在细胞中合成大量不同有机物以降低细胞的渗透势。四是合成保护蛋白，又称渗透胁迫蛋白【4】。1.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）研究进展1.2.1液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征 植物胞内NHX家族分为两类，分别用符号I和II表示。所有的NHX I类成员都定位于液泡膜上，并在胞内形成一个独立的转运子分支。相对而言，II类的成员存在于植物内膜囊泡上，同时也包括定位于动物和细菌中多种内体上的同源蛋白。在已知基因组全序列的拟南芥和水稻中，NHX基因家族的序列大小几乎相同。拟南芥有6个NHX基因（AtNHX），水稻有5个NHX基因（OsNHX）。它们的分配方式相似，AtNHX1-4和OsNHX1-4构成I类,AtNHX5-6和OsNHX5构成II类。拟南芥和水稻的I类组成员显示出56.0-87.5%的相似性，而II类成员的相似性为78.7%，但是与I类的相似性只有21%-23%【5】。Zorb等【6】克隆了玉米(Zea mays L.)NHX家族的六个成员ZmNHX16，其中，ZmNHX1，2，6 属于一个亚家族，与拟南芥AtNHX1，2 同源性高，而ZmNHX3，4，5 属于另一个亚家族，与拟南芥AtNHX46 同源性高。这六个成员具有器官和盐处理特异性的表达模式。分析植物Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的亲水性图谱包括N末端的跨膜区域和C末端的胞质区域。前者对氨氯吡嗪脒（amiloride）及其衍生物敏感，是负责转运的区域，由9-12个跨膜结构域组成。后者大约由300个碱基组成，结构域内含有多个蛋白激酶作用位点，能够与钙调素（calmodulin）结合，参与多种信号反应，是调节活性的区域【7】。Yamaguchi等【8】分析了 AtNHX1 的膜拓扑学结构，他们发现 AtNHX1 蛋白的整个结构不同于人的Na+/H+交换蛋白NHE1和任何已知的其他Na+/H+逆向转运蛋白。AtNHX1由9个跨膜区域和1个亲水的C末端结构域组成，其中3个推测的疏水跨膜区TM3、TM5、TM6看上去与膜相连，实际上并没有跨过液泡膜。他们的结果还表明，AtNHX1的N末端朝向胞质，但几乎整个C末端都位于液泡腔中。与其蛋白家族的其他基因相比，AtNHX1 N末端很保守，对于Na+/H+逆向转运蛋白的活性非常重要。AtNHX1的TM3区具有一个推测的氨氯吡嗪脒结合序列(FFIYLLPPI)，这段序列在其他植物 NHX以及哺乳动物NHE中均高度保守，氨氯吡嗪脒与真核生物Na+/H+逆向转运蛋白结合后能抑制其转运活性。AtNHX1的TM5和TM6与人NHE中高度保守的TM6和TM7相对应，TM6和TM7对NHE1的转运活性很重要，但 AtNHX1的TM5和TM6区不跨膜，所以很难说它们对于AtNHX1的转运活性起重要作用。另外，AtNHX1的TM3与TM5、TM6可能分别构成了胞质和液泡中结合离子的结构，它们的方向决定离子运动的方向。Rajagopal等【9】对珍珠栗Pennisetum glaucum液泡膜Na+/H+转运蛋白PgNHX1与AtNHX1、OsNHX1做了比较，后者含有9个跨膜结构域，而PgNHX1为5个跨膜结构域包括一个钙素结合区域，调控PgNHX1的活性，TM3、TM4区与AtNHX1、OsNHX1的保守性较高。Yamaguchi等【10】进一步分析了位于液泡腔内C末端，AtCaM15(类似钙调素的蛋白)位于C末端，依赖于Ca2+和pH值，调控Na+/H+转运蛋白底物的选择性，以及液泡中的 pH 值调控Na+/H+转运蛋白与阳离子亲和性。AtNHX1 C末端的缺失使Na+/H+选择比率增加一倍，证实C末端的调节功能。1.2.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现 NHX1基因在植物耐盐性的作用主要表现在以下三方面：一是利用液泡膜H+-ATPase和液泡膜H+-PPiase产生的跨膜质子梯度将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡中【5】，这样降低了胞质内的Na+含量，维持胞质正常的K+/Na+比值,而且可以有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂,降低Na+对植物细胞的毒害作用【11】。即使在胞质内Na+浓度很低的情况下，Na+ 也可主动泵进液泡中，Cl-则被动的由阴离子通道进入液泡平衡膜内外的电荷差别【12】。；二是Na+/H+逆向转运蛋白的C末端对其转运活性和离子选择性的调控，植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的C末端比质膜Na+/H+逆向转运蛋白的C末端短得多，仅有100多个氨基酸。AtNHX1的N末端朝向胞质而整个C末端亲水区域都在液泡内，Yamaguchi等【6】的转运研究认为AtNHX1的C端调节转运蛋白阳离子的运输，C末端可能是糖基化或其它蛋白修饰的位点。利用酵母异源表达系统进行末端缺失实验中，N末端缺失17个氨基酸引起Na+/H+转运活性轻微降低和K+/H+转运活性的少量增加。亲水性C末端的82个氨基酸缺失使Na+/H+转运活性大大增加，而这种缺失导致K+和H+的运输速率相对降低，Na+和K+的运输比率也是未修饰的两倍。说明AtNHX1的C末端对Na+/H+逆向转运蛋白活性及底物选择性具有调控作用。另外，Yamaguchi等【8】异源表达酵母细胞的实验表明AtCaM15(类似钙调素的蛋白) 定位于液泡腔内的AtNHX1 C末端，依赖于Ca2+和pH值，随pH值的升高降低与AtNHX1的连接，同时改变转运体对Na+/H+的选择性。关于C末端的作用以及调控机制，还有待于人们更进一步的研究。三是NHX1基因在NaCl存在下诱导表达，同时NaCl、KCl、ABA正调控AtNHX1的转录水平，在盐胁迫和ABA调控AtNHX1的表达实验【13】中，NaCl、KCl、ABA可以正调控AtNHX1的转录水平。对转基因拟南芥AtNHX1启动子-GUS的分析结果启动子区包含推测的 ABA反应元件(ABRE)，位于起始密码的736-728之间，ABRE元件存在于不同物种对ABA应答的基因中。由于AtNHX1启动子的活性可被NaCl、KCl和ABA上调,表明AtNHX1的表达受盐和ABA的上调是在转录水平上的调控。NaCl对AtNHX1的上调程度在abi1-1(ABA不敏感突变体)、aba2-1和aba3-1(ABA缺乏突变体)中被减少，但在突变体abi2-1、sos1(质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1突变体)、sos2(蛋白激酶基因SOS2突变体)和sos3(钙结合蛋白基因SOS3突变体)并无类似情况发生。ABA诱导的AtNHX1的表达同样在abi1-1中被减少，但abi2-1中没有。这些结果表明，盐胁迫下在转录水平上AtNHX1表达的增强，部分地依赖于ABA的生物合成和ABA通过ABI1发出的信号。ABI1可以调控NHX1等基因的表达，ABI2则可以通过抑制SOS2的激酶活性或SOS2底物的活性来负调控离子均衡。1.2.3 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的功能研究 目前在这方面的研究主要从以下几方面展开：一是NHX1基因表达可部分恢复酵母nhx1突变表型，Xia等【14】利用RT-PCR从甜菜Beta vulgaris Linn.中克隆出与拟南芥NHX1同源的BvNHX1基因。将Bvulgaris Na+/H+转运蛋白基因BvHNHX1在对盐敏感的酵母nhx1突变体ena1-4nhx1菌株中异源表达，结果证实BVNHX1至少与酵母NHX1基因功能部分等价。Hamada等【15】从盐生植物滨藜中克隆出Na+/H+转运蛋白，命名AgNHX1。同时将其在酵母NHX1突变体中表达结果对NHX1的功能有部分互补性。而Gaxiola 等【16】将AtNHX1在对NaCl敏感的酵母nhx1突变体菌株中进行异源表达，结果表明AtNHX1能抑制nhx1突变体的敏感表型，AtNHX1的某些功能和酵母NHX1是等价的，AtNHX1恢复酵母nhx1突变体Na+耐性的功能与酵母内源的ScNHX1功能相似。二是拟南芥植物过量表达AtNHX1基因，转基因植株在200mmolNaCl的条件下生长发育良好。Apse等认为耐盐性的提高与ANHX1的高水平转录，翻译及Na+/H+转运体活性有关【17】。Junsheng Zhao等将AtNHX1转到tall fescue (Festuca arundinacea)中，过量表达AtNHX1基因可以显著提高转基因植物耐盐性，200mM NaCl溶液中，显出比对照组更强的耐性。在根细胞的液泡中积累了更多的Na+，归因于Na+/H+逆向转运体活性的增强。他们认为Na+/H+转运体促进Na+在根细胞的液泡中积累，减少了盐的毒害作用也就增强了植物耐盐性【18】。Xue等【19】在小麦中过量表达AtNHX1，发现转基因小麦在盐土壤中谷粒产量提高，并且谷粒大而重。在100150mM NaCl条件下，转基因植株与对照组相比，叶中积聚的Na+浓度较低，K+浓度较高。这些结果表明，提高液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白转录水平，能使小麦的耐盐性及在盐土壤中谷粒的产量提高。Gaxiola等【20】的实验进一步证实耐盐性是由于液泡转运体的存在，他们将拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1及H+-PPase基因AVP1同时过量表达获得的转基因植株，结果比单独过量表达两者之一的转基因植株具有更强的耐高盐的能力。这些结果显示拟南芥液泡膜焦磷酸酶(H+-PPase)AVP1的过量表达，明显增加了转基因植株跨液泡膜质子梯度，促进了AtNHX1介导的活性，将Na+更多的区隔化至液泡。为了较深入研究NHX1基因的作用，国内外研究员做了很多的探讨。Sottosanto等通过T-DNA插入突变体NHX1植株和分析atnhx1缺失突变体DNA芯片，发现在对照及 100mM NaCl盐胁迫的土壤条件下，探讨成熟植物缺失AtNHX1基因对其他转录本的影响，发现nhx1均影响了转录本的表达，而在100mM NaCl胁迫下基因的变化更大；其次，在离子动态平衡方面，细胞内囊泡运输，蛋白质定位以及其它细胞过程中发挥作用【21】。Rajagopal等【9】认为PgNHX1功能在整个生命周期都起作用，Na+大都积累在老叶中，种子中极少。自1976年分别首次在动物老鼠肾细胞质膜上和植物大麦质膜上发现Na+/H+逆向转运蛋白。后发现的Na+/H+逆向转运蛋白广泛存在于细菌、酵母、藻类、动物和高等植物的膜系统上。目前在GenBank上登录的Na+/H+逆向转运蛋白核酸序列达到500多个。包括人类Na+/H+转运体NHE1【22】、盐生植物中间偃麦草Elytrigia intermedia TiNHX1【23】、盐地碱蓬S salsa SsNHX1【24】、甜土植物甜菜BvNHX1【14】、经济作物小麦TaNHX1【25】、水稻OsNHX1【26】、刺槐RpNHX1【27】等动植物的Na+/H+逆向转运蛋白。1.3 本研究的目的及意义白刺属（Nitraria L.）是蒺藜科(Zygophyllaceae)的古老小属，中国有8种，内蒙古有4种.该属植物是我国内蒙古、甘肃和新疆一带荒漠植被的重要建群种之一，为耐干旱、耐盐碱、抗风蚀沙埋、生长快、易繁殖的优良防风固沙先锋植物。白刺属植物具有很高的开发利用价值，如营养保健价值、药用价值、生态价值、经济价值等。而基于白刺特有的耐盐碱抗旱能力，受到盐、碱、旱的三重胁迫，其基因和蛋白水平的表现必定与目前研究的植物耐盐机理存在较大差异。张建秋等研究发现，他们克隆到的白刺盐碱胁迫相关基因片段与目前已知的植物耐盐基因存在较大差异，这预示着白刺可能存在较特殊的耐盐碱机理【28】。他们通过双向电泳分析白刺盐胁迫蛋白，发现某些特异性表达蛋白在其他耐盐植物的研究中没有被发现，部分证明了可能存在不同于其他植物耐盐性的机理，因此对盐碱均有较高的耐受性【29】。因此从分子生物学角度探讨耐盐机理具有重要的理论意义，目前对白刺的研究主要是生态学方面的，对其耐盐碱基因的报道非常少，还未发现白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因的相关报道。本研究中我选择了生于轻度盐渍化低地、湖盆边缘、干河床边，可作为优势种并形成群落的小果白刺。肌动蛋白最初于1949年在动物骨骼肌细胞中发现并加以命名，我国科学家闫隆飞等在1963年首次提出高等植物存在肌动蛋白【30】，肌动蛋白广泛存在于高等植物的各种组织细胞中，如花粉、茎韧皮部、叶表皮细胞、叶鞘细胞、根毛、卷须等，它是构成细胞骨架的主要结构蛋白。植物肌动蛋白通常由376-377个氨基酸组成，肌动蛋白利用其分子表面与很多肌动结合蛋白发生相互作用，植物肌动蛋白具有高度保守性。理想的内参基因应该满足:不存在假基因，以避免基因组DNA的扩增。稳定表达于不同类型的细胞和组织中，而且其表达量无显著性差别等条件，高度或中度表达，但不是太高或低表达;稳定表达于不同类型的细胞和组织中，而且其表达量是近似的，无显著性差别;表达水平与细胞周期及细胞是否活化无关;不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。Actin基因是管家基因之一，在各种不同器官上恒定表达，因而它可以用作分子内标来研究其它基因的表达差异。现在还没有白刺肌动蛋白基因的克隆报道，本文旨在克隆其肌动蛋白基因，分析基因序列确证该基因作为分子内参的可能性，为研究白刺其他基因的表达奠定基础。2 材料与方法2.1 材料 2.1.1植物材料的培养实验所用材料为小果白刺（Nitraria sibirica Pall.），别名西伯利亚白刺【31】，实验室快繁试管苗（陈贵林教授赠予），培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L+50mM NaCL, 温度为(25±1),光照强度3640mol ·m-2·s-1,光照时间14 h·d-1【32】。2.1.2 实验试剂及配制（1）500mM EDTA溶液（提RNA用DEPC处理水配制），pH=8.0.（2）5M Nacl（提RNA用DEPC处理水配制）.（3）10MLiCl，4保存.（4）1MTris-HCl（RNA用DEPC处理水配制），pH=9.5,冷却后校正pH值.（5）10×MOPS RNA电泳液，700mLDEPC处理的灭菌水溶解41.8g MOPS，用2M NaOH调pH至7.0，加20mLDEPC处理的1M的乙酸钠和20mlDEPC处理的0.5M的EDTA（pH=8.0）。DEPC水定容至1L。（用0.45um的滤膜过滤除菌，室温避光保存）（6）50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液 成分及终浓度配制1L溶液各成分的用量242g Tris57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L）200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）补足1L （7） CTAB提取RNA缓冲液为：2% (w/v)g/mlCTAB100 mmol/LTris-HCl (pH 8.0)1.4 mol/LNaCl20 mmol/LEDTA (pH 8.0)0.2%-巯基乙醇(使用前加入)DEPC处理水定容到 500 ml（8）TE buffer（10mM Tris pH=8.0、1mM EDTA pH=8.0）.（9）酚/氯仿/异戊醇phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCA 25：24：1)25份水平衡酚，24份氯仿，1份异戊醇混合，加入8-羟基喹啉Hydroxyquinoline，使其终溶度为0.1%.（10）氯仿/异戊醇chloroform/isoamyl alcohol (CA 24：1)（11）水平衡酚制备 500g苯酚加入200ml灭菌DEPCH2O ，平衡，直至饱和，加入8-羟基喹啉Hydroxyquinoline，终溶度为0.1%.（12）3M 醋酸铵（pH 5.2）.（13）氨苄青霉素Ampicillin (100mg/ml )，0.22m过滤膜过滤除菌. （14）IPTG (24mg/ml) ，0.22m过滤膜过滤除菌.（15）X-Gal （20mg/ml），加入DMF(二甲基甲酰胺)溶解，使其终浓度为80%，-20避光保存。（16）LB培养基（1%（W/V）Trytone，0.5% Yeast Extract ，1%NaCl，pH 7.0）（17）LB/AMP培养基（1%（W/V）Trytone，0.5% Yeast Extract ，1%NaCl，0.1mg/ml Ampicillin（18）SOB培养基（2%（W/V）Trytone，0.5% Yeast Extract ，0.05%NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl）（19）SOC培养基（2%（W/V）Trytone，0.5% Yeast Extract ，0.05%NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl，20M葡萄糖（20）TB溶液Transformation Buffer HEPES 3.0g 10mM，CaCl2.2H2O 2.2g 15mM，KCl 18.6g 250mM，加入蒸馏水 950ml，用 5M KOH 调PH至6.7-6.8 ，低PH不溶，在加终浓度为55mM的MnCl2.4H2O 10.9g，定溶到1L, 过滤灭菌, 4度保存。2.1.3 实验使用试剂盒（1）TaKaRa RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0（2）AXxyPrep DNA凝胶回收试剂盒2.1.4实验用引物实验用引物由invitrogen 公司合成DegNHX-F：5- CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG -3 PPIIFNAGDegNHX-R：5 -RTAIGCCATIARCATCAT -3 MMLMAYDeg Act-1：5- ATGGTIAARGCIGGITTYGC-3 MVKAGFADeg Act-2：5- CCACATYTGYTGRAAIGTIS-3 STFQQMW3RACE 特异性引物NHX-GSP-F（1）：5-ATTTTGCCAGGCACTCAA-3NHX-GSP-F（2）：5-TGCTTGGCGTCATTACTGGA-3iPCR 特异性引物NHX-R：5-TCACCTGGAATCCCGCAT-3NHX-F：5- ATTTGAACACCAGCTCGGCTTT-32.1.5 载体及菌株（1）pMD18-T Vector （TaKaRa），可利用M13RV引物和M13M4引物进行测序，同时含有编码-半乳糖苷酶（lacZ）-肽的基因，可以根据互补原理通过插入失活显色对重组子进行筛选。（2）E.coli DH5菌2.1.6 主要仪器设备及其他RNase A、dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶等购自TaKaRa公司或上海生物工程公司，苯酚、丙酮、氯仿、-巯基乙醇Tris、EDTA、NaCl、MgCl2、CaCl2、NaOH、NaAc、IPTG、X-gal、氨苄青霉素（Amp）等为上海Sagon、invitrogen或国药等公司。PCR仪BIO-RAD C1000Tm Thermal Cycler、 电子天平 sartorius BS223s 、微波炉 G7020IIYSL-V1 、电泳仪 DYY-6D型、 涡旋振荡器QILIBEIER QL-861 VORTEX SHAKER 、QILIBEIER VORTEX-5 型、LX-200 迷你离心机、TG16A-W 微量高速离心机、TGL-16M 高速台式冷冻离心机、eppendorf centrifuge 5415 R、高压灭菌锅 AUTO clave HVE-50、SANYO MDF-U32V 超低温冰柜、UVitec 凝胶成像系统、TH2-C-1台式冷冻恒温振荡器。2.2 实验方法2.2.1 兼并引物设计利用NCBI数据库查找不同植物NHX1基因的氨基酸序列，比对同源性（Clustal W），根据保守区域设计兼并引物（其中R=A/G,Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T）。同时考虑引物本身的GC含量（与TM值有关）和其他引物设计原则。根据GenBank公布的拟南芥、玉米、苜蓿、盐芥等植物的Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列，ClustalX软件进行多序列同源性比对。在高度保守区域内设计一对兼并引物，由invitrogen公司合成，序列如下：DegNHX-F：5- CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG -3DegNHX-R：5 RTAIGCCATIARCATCAT -3肌动蛋白的兼并引物则采用已发表文献克隆水稻actin 基因的序列，序列如下：DegAct-1：5- ATGGTIAARGCIGGITTYGC -3DegAct-2：5- CCACATYTGYTGRAAIGTIS -3图2.1 为七种Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列比对结果（AtNHX1，ThNHX1，BnNHX1，ZmNHX1，AgNHX1，SSNHX1，MsNHX1分别为拟南芥、盐芥、油菜、玉米、滨藜、盐地碱蓬和苜蓿的逆向转运蛋白的氨基酸序列，在Genbank的登录号分别为NM122597.2，DQ995339，AY189676.1，NM001111751.1，AB038492.1,AF370358.1，AY456096.1）。“*”表示保守，“：”表示次保守，箭头所示为兼并引物位置。2.2.2 白刺总RNA的提取及鉴定2.2.2.1改良的CTAB法提取植物总的RNA【33】（1）65预热10ml2%CTAB提取缓冲液（加入0.2%-巯基乙醇）；（2）液氮中研磨1g新鲜植物组织；（3）在研钵中加入预热的CTAB提取液，解冻后用剪宽了的枪头移入10ml离心管中，干式恒温器中65孵育15min；（4）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）并涡旋混匀10min，6000 rpm离心10min；（5）将上清转移至一新离心管中，重复抽提一次；（6）将上清转移至一新离心管中，加入1/4 体积LiCl,4°C下沉淀过夜；（7）4 6000rpm离心10min，弃上清，用1mL TE buffer溶解沉淀，加入等体积水平衡苯酚，冰浴5min；（8）8000rpm 离心10 min，取上清，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提一次；（9）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清；（10）可重复操作上步骤，直到看不到中间层；（11）上清移入1.5ml离心管中，加入1/4体积LiCl，-20沉淀2h；（12）4 6000rpm离心10min，弃上清，加500 L70%乙醇洗沉淀，吹干后用30LDEPC水或TEbuffer溶解RNA。2.2.2.2 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳甲醛琼脂糖凝胶电泳参照分子克隆手册（第三版）的方法进行，胶浓度为0.8%，检测总RNA的完整性。紫外分光光度计测定RNA在260nm和280nm处的光吸收值（OD值），确定RNA的纯度及浓度，再根据其浓度计算RNA 电泳加样量，RNA电泳加样 3-5 mg。（1）配制1.0%的琼脂糖凝胶（50mL）