HPLC测定维生素D滴剂(胶囊型)中维生素D3的含量 开题报告.doc

12用HPLC测定维生素D滴剂（胶囊型）中维生素D3的含量（开题报告）HPLC测定维生素D滴剂（胶囊型）中维生素D3的含量药学092夜本(26092106) 张佳荣摘要：国际对维生素D的大量深入研究显示：维生素D不再被认为是仅仅用于预防儿童佝偻病的营养必需品。市面上存在大量各种厂家的维生素D3的产品，但中国药典并未收录维生素D3滴剂的含量相关检测方法。关键词：维生素D滴剂（胶囊型），维生素D3，正相HPLC，反相HPLC1. 研究背景1.1 研究意义近年来，国际对维生素D的大量深入研究显示：维生素D不再被认为是仅仅用于预防儿童佝偻病的营养必需品。维生素D对健康的意义被更加广泛的认知，并在大量临床试验中得到证实，这其中包括：降低常见癌症的发生率，如乳腺癌、肺癌、结肠癌等。 防治自身免疫性疾病、高血压和感染性疾病等。维生素D调节胎盘的发育和功能，这表明孕妇维持较好的维生素D水平可预防如流产，先兆子痫，和早产等妊娠并发症的发生。宫内及婴幼儿获得足够的维生素D可降低1型糖尿病，哮喘与精神分裂症的发生率。 总的来说，维生素D缺乏的治疗和预防对于所有人群，尤其是妇女儿童的整体健康发展是非常重要的。大多数的维生素D由DBP(维生素D结合蛋白质)或脂蛋白携带到肝脏，在侧链C-25位上羟化形成25-（OH）D3,它是主要的循环形式。维生素D25羟化酶包括两种形式的细胞色素P-450混合功能氧化酶，一种在内质网上的低亲和力高容量酶，另一种则是在线粒体上的高亲和力低容量酶，25羟化酶主要受维生素D在肝脏的浓度调节，几乎不被25-（OH）D3抑制。25-（OH）D3不储存在细胞内，它被释放到血浆中和DBP结合，在正常的25-（OH）D3的血浆浓度时，仅有少量的25-（OH）D3从血浆释放入组织。因此25-（OH）D3的循环水平是良好的维生素D营养状况的测试指标。维生素D的缺乏与摄入量以及日照时间有关，所以很难确切估计。但就目前紫外线照射带来的皮肤癌等问题上升的情况下，各国人群接受日照的时间都在减少，并且很多国家明确规定要限制接受日照的时间，因此全世界范围内维生素D均呈现广泛缺乏的现象。 中国部分居民血液中的25-（OH）D3水平检测发现，约60%以上的居民为缺乏，只有约6%的人群达到优秀水平。其中，最易缺乏，并因为缺乏容易出现疾病的人群包括：孕妇、婴幼儿、老年人。这主要与这三类人群接受日照时间都相对较少有关。2000年中国营养学会制定的中国居民膳食维生素D推荐摄入量见表1.1。 年龄（岁）IU/d年龄（岁）（单位IU/d）010400孕妇4001149200乳母40050400表1.1：中国居民膳食维生素D推荐摄入量世界各国对维生素D 需要量指导：中华医学会儿科学分会（2008年3月）：早产儿、低体重儿、双胞胎：2周后800IU/d，三个月后400IU/d。纯母乳喂养的婴幼儿：2周-2岁，400IU/d。配方奶喂养儿：如果奶量少于500ml，补充200IU/d。妊娠后期为秋冬季的孕妇：400-1000IU/d，同时监测25-(OH)D3浓度。美国儿科学会临床指南（2008年11月）：与中国相比，提前和延长了补充维生素D的年龄段，孕妇（妊娠后期）、乳母，不管什么季节都需要补充维生素D 400-1000 IU/d。在包括美国、澳洲等世界发达国家的各类医学文献中，对各个人群的维生素D推荐剂量，均高于目前中国的推荐剂量，综合下来见表1.2。年龄（岁）推荐摄入量（单位IU/d）019400-10002050400-100051691000-2000701000-2000表1.2: 个人群的维生素D推荐剂量通过膳食来源的维生素D一般不会引起中毒，也就是说天然的维生素D，和食品级的天然维生素D补充剂一般不会引起中毒。而大剂量的化学维生素D和强化维生素D的奶制品有发生维生素D过量和中毒的可能。中国营养协会建议我国儿童和成人的可耐受最高摄入量为800IU/d。但从目前国际对D3的应用看来，大部分国家在日照较少的季节，对婴幼儿的日摄入量已经提高到800-1000IU/d，而孕妇和普通成人如果检测为维生素D缺乏，在开始1-2个月，日摄入量会要求提高到2000 IU/d甚至更多。 医学分析表明，将维生素D摄取量增至1000IU/d可能降低结肠癌和乳腺癌的患病几率50%。男性摄入维生素D400IU/d可大幅降低患多种癌症的几率，包括胰腺癌、食道癌和非霍奇金淋巴瘤。孩子在生命的第一年期间每天摄入2000IU的维生素D，在30年随访期间1型糖尿病的风险降低80。1.2 药物的来源维生素D是一种脂溶性维生素，也被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，它与阳光有密切关系，所以又叫“阳光维生素”。维生素D是一族A、B、C、D环结构相同，但侧链不同的一类复合物的总称，A、B、C、D环的结构来源于类固醇的环戊氢烯菲环结构，目前已知的维生素D至少有10种，但最重要的是维生素D2（麦角骨化醇）和维生素D3（胆钙化醇）。 维生素D2是紫外线照射植物中的麦角固醇产生，在自然界存在较少。维生素D3则由大多数高级动物的表皮和真皮内含有的7-脱氢胆固醇经紫外线（波长265228nm）照射转变而成。维生素D3是维生素D中生物代谢率最高的一种活性形式。在后文中提到的维生素D主要指维生素D3 维生素D3（胆钙化醇）主要是由人体自身合成的，人体的皮肤含有一种胆固醇，经阳光照射后，就变成了维生素D3。所以，如果孩子能充分接受阳光的话，自身合成的维生素D3，就基本上能满足。另外，维生素D3还可来自动物性食物，如肝类，尤其是由海产类的鱼肝中提炼的鱼肝油。维生素D3除存在于少数动物性食物之外，主要是皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射后形成的，而7-脱氢胆醇则是由胆固醇转变生成的，所以有人叫它太阳维生素。 1936年，人们从鳕鱼中发现了维生素D3。以后发现了维生素D3的生理功能是促进肠道钙吸收，诱导骨质钙鳞沉着和防止佝偻病。维生素D3对钙代谢的调节是通过与胞核1，25-（OH）2D3受体的结合而达到的。不久人们又发现，在皮肤、肌肉、胰腺、脑、造血细胞和肿瘤细胞中发现均有这种受体。1981年有人首先在小鼠的骨髓白血病细胞中发现，维生素D3具有调节细胞生长的作用，包括诱导细胞的正常分化和抑制细胞的过渡增殖。由此，人们联想到能否用维生素D3来治疗肿瘤、银屑病等细胞过渡增殖的疾病。但直接应用维生素D3及时美籍日记未可也能导致高钙血症、高钙尿症和软组织钙化。丹麦利昂公司为了找出一种维生素D3的衍生物，既能调节细胞生长，对钙代谢的影响不大，并终于在1985年合成钙泊三醇。与此同时日本学者用1-OHD3治疗一老年骨质疏松患者，意外发现其银屑病亦好转。日本株式会社也合成他骨化醇。钙泊三醇与他骨化醇可外用治疗银屑病。钙泊三醇与他骨化醇都是维生素D3的类似物，均能抑制银屑病表皮细胞的异常增值，及诱导银屑病表皮细胞的分化。这是他们治疗银屑病所以有效的道理。维生素D3以海肝含量最为丰富，如每100克鳕鱼、比目钱及剑钱肝中分别含维生素D3200750微克、50010000微克、25000微克。其他如鲱鱼、鲑鱼、沙丁钽及鲳鲸等含有少量；禽畜肝脏、蛋类和奶类也是含有少量，每100克含量在100微克以下。在一般情况下，单靠从食物中获得足够的维生素D3是不容易的，所以通过日光浴在体合成维生素D3是一个别重要途径。1.3维生素D3的临床应用及大剂量的毒性维生素D除防治维生素D3缺乏病外1-25（OH）2D3可防治下列病症：肾性骨病，肾功能不全缺少1位羟基化酶，体内不能合成1-25（OH）2D3必须从体外摄取；难治疗抗维生素D3佝偻病，由于遗传因素，磷从肾排出过多；甲状旁腺素缺少症，患者不能在低血浆Ca时产生1-25（OH）2D3；抗维生素D的佝偻病，维生素D供应正常但仍有佝偻病，由于代谢上的缺陷，不能1位羧基化；癫痫病人使用苯巴比妥可能导致骨病。也可用25（OH）2D3的生理剂量为1g/天。此剂量也可作为治疗剂量。维生素D中毒剂量与生理剂量相差不多，婴儿服用50g（200IU）或更少一些可以导致血钙过多，肾功能不全。成人中毒剂量个体差异较大，有人口服2000IU中毒现象，口服5000IU者易中毒，口服量不能超过800IU。用维生素D治疗时，要检查血钙水平，如血钙正常不致中毒，轻度中毒有呕吐，食欲不振等现象，重者可致死亡。维生素D毒性可由于血流中25（OH）2D3水平高代替1-25（OH）2D3与蛋白受体结合，因此1-25（OH）2D3不能进入细胞，也不能起控制钙的吸收及动员骨钙的作用，因此血钙水平高，而使肾、心脏及主动脉钙化，治疗维生素D过多时可用低钙膳及动员骨钙的作用，因此血钙水平高，而使肾、心脏及主动脉钙化，治疗维生素D过多时可用低钙膳及糖皮质激素以减低血清钙的水平。中毒时尿中排出Ca量过多比血钙过高发生较早，尿钙过高易形成肾结石。维生素D及25（OH）D3可以储存，维生素D储存时间一般为14个月，有的可达18个月之久。维生素D代谢物也可产生中毒现象，但由于其生物半衰期短，中毒时间也较短，25（OH）D3可达数周，1-25（OH）2D3仅有数日。2. 文献综述维生素D3的含量测定参考方法：2.1参考方法1：对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D3对照品25mg，置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D的校正因子f1。另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后，密塞，置90水浴中加热15小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f2。 含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定，计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。 2.2参考方法2：对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D3对照品25mg，置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D的校正因子f1。另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后，密塞，置90水浴中加热15小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f2。供试品制备 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50(g/g)氢氧化钾溶液3ml若供试量为3g，则加50(g/g)氢氧化钾溶液4ml，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。净化用色谱柱系统分离收集维生素D，精密量取上述供试品溶液A 500l,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇乙腈水(50502) 为流动相进行分离，检测波长为254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素D与前维生素D为叠峰，并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于2ml，并使每1ml中含维生素D为50140单位，内标物质与维生素D的重量比约为41)，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液B。含量测定 取供试品溶液B，进样量为100200l。计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。2.3参考方法3：色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷正戊醇（9973）为流动相，检测波长为254nm。供试品溶液的制备 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50(g/g)氢氧化钾溶液3ml若供试量为3g，则加50(g/g)氢氧化钾溶液4ml，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。净化用色谱柱系统分离收集维生素D，精密量取上述供试品溶液A 500l,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇乙腈水(50502) 为流动相进行分离，检测波长为254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素D与前维生素D为叠峰，并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，加入异辛烷2ml溶解，通氮排除空气后，密塞，置90水浴中，加热1.5小时后，立即通氮在2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即为供试品溶液C。对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D50单位，精密量取2ml置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法，自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。 含量测定 取对照品溶液与供试品溶液C，交替精密进样200l，量取维生素D的峰值，按外标法计算含量。 2.4参考方法4：对照品贮备液（1）的制备 精密称取维生素D3对照品0.025g于100m棕色容量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，超声1分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀。对照品贮备液（2）的制备 精密量取对照品贮备液（1）5ml置50ml容量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，以正己烷-正戊醇（997:3）为流动相，检测波长为254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备液（2）5ml至50ml容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素D3的校正因子f1。再精密量取对照品贮备液（1）5ml至50ml容量瓶中，加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90水浴加热1.5小时后，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素D3的校正因子f2。含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定，计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。2.5参考方法5：对照品贮备液（1）的制备 精密称取维生素D3对照品0.025g于100m棕色容量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，超声1分钟使完全溶解，用异辛烷稀释至刻度，摇匀。对照品贮备液（2）的制备 精密量取对照品贮备液（1）5ml置50ml容量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0以下保存。色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，以正己烷-正戊醇（997:3）为流动相，检测波长为254nm。校正因子测定 精密量取对照品贮备液（2）5ml至50ml容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素D3的校正因子f1。再精密量取对照品贮备液（1）5ml至50ml容量瓶中，加2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒，通氮排除空气后，密塞，置90水浴加热1.5小时后，取出，迅速冷却，用正己烷稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算维生素D3的校正因子f2。精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50(g/g)氢氧化钾溶液3ml若供试量为3g，则加50(g/g)氢氧化钾溶液4ml，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60100ml分数次洗涤，洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化，直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。净化用色谱柱系统分离收集维生素D，精密量取上述供试品溶液A 500l,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇乙腈水(50502) 为流动相进行分离，检测波长为254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素D与前维生素D为叠峰，并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干，精密加入正己烷溶液适量并使每1ml中含维生素D为50140单位，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液B。含量测定 取供试品溶液B，进样量为100200l。计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。2.6文献结论：对上述含量测定方法进行了实验对比。发现参考方法1，参考方法4，未能排除样品中的杂质干扰，故排除。参考方法3，方法过于复杂，实验时间过长，并且出现偏差的概率高，故排除。参考方法5相对参考方法2而言对仪器要求略高，增加了检验成本。故采用参考方法2的检验方法的基础上在加以改进。3. 技术路线3.1色谱条件ZORBAX硅胶柱(5m，4.6×150mm)，流动相：正己烷-正戊醇（986:14），检测波长：254nm，3.2阴性试验测试在上述色谱条件下，在样品在色谱的峰是否达到基线分离，且阴性对照无干扰。3.3线性关系试验测试维生素D3的在一定的浓度范围内，与峰面积是否呈良好的线性关系。3.4精密度试验测试在论文的检测方法下，精密度是否符合标准。3.5重现性试验测试在论文的检测方法下，重现性是否符合标准。3.6稳定性测定测试在论文的检测方法下，样品在6小时内是否稳定。3.7回收率试验测试在论文的检测方法下，回收率是否符合标准。3.8样品含量测定对3批次的样品进行含量检测。4. 进度安排2011年6月至8月查找并阅读与研究课题相关的文献资料，了解课题的背景、研究目的以及实验方法，翻译其中的外语文献。2011年8月至9月根据前期所查找的相关文献，完成相关的开题报告，并且做好进入实验室的各项准备工作。2011年9月至10月进入实验室，熟悉实验操作和流程，试验各种条件对结果可能产生的影响。2011年10月至11月更具最终确定的实验方法进行实验方法的验证，并进行样品的含量测定2011年11月上旬至11月中旬整理实验数据，完成毕业论文。2011年11月中旬至11月下旬修改完善论文，上交论文。5. 参考文献1 国家药典委员会. 中华人民国药典.二部.2005维生素AD滴剂2 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2005 K 维生素D测定法 第一法3 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2005 K 维生素D测定法 第二法4 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2005 K 维生素D测定法 第三法5 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2010 K 维生素D测定法 第一法6 国家药典委员会. 中华人民国.一部.2010 K 维生素D测定法 第二法7 国家药典委员会. 中华人民国.二部.2005维生素D38 国家药典委员会. 中华人民国.二部.2005维生素D2胶丸9 李淑媛. 临床营养学. 北京大学医学出版社. 2006版10 章有章、查锡良、李刚. 生物化学与分子生物学. 科学技术文献出版社. 2005-10第1版11 The United States Pharmacopieial Convention. United States Pharmacopoeia. USP32-NF27. Oleovitamin A and D12 The United States Pharmacopieial Convention. United States Pharmacopoeia. USP32-NF27. VITAMIN D ASSAY13 British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia 2009. Paediatric Vitamins A, C and D Oral Drops